王振海团队揭示多西环素诱导布鲁杆菌侵染的人小胶质细胞凋亡新机制

撰文︱王   钊

责编︱王思珍

神经型布鲁杆菌病（neurobrucellosis）是一种慢性且危及生命的传染病，因诊断与治疗不足，可导致患者发展为慢性感染[1]。该病慢性化是由于布鲁杆菌（Brucella）侵入小胶质细胞（microglia）并在其内部复制、增殖与存活引起的[2-4]。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的“本土”免疫细胞[5-8]，在宿主大脑防御细菌感染中起重要作用[9]。布鲁杆菌进入宿主细胞后，通过IV型分泌系统（T4SS）或毒力调节蛋白（BvrR）形成含菌空泡（Brucella-containing vacuoles，BCVs），这有助于其定植内质网（ER）[10-12]，进而抑制宿主细胞凋亡（apoptosis）。通过这一策略布鲁杆菌逃避宿主免疫反应以建立慢性感染[10]。然而，布鲁杆菌抑制细胞凋亡的机制未知。这正是本课题研究的主要内容。

由上可知，诱导感染细胞的凋亡可限制细菌的存活[13]。多西环素（doxycycline，DOX）是一种四环素类抗生素[14]，通过触发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）诱导细胞凋亡而被用于治疗胞内菌感染，但DOX诱导感染细胞凋亡的分子机制尚不清楚。钙网蛋白（calreticulin，CALR）是ER的一种钙储存蛋白[15]，已有研究表明CALR在宿主细胞中发挥抗凋亡作用[16]。c-Jun氨基酸末端激酶（JNK）信号通路是ER相关凋亡的一个关键调节因子[17-18]，细菌感染触发ERS可激活JNK信号通路[19]，但CALR和JNK信号通路间的联系及其在凋亡调节中的作用尚未受到关注。那么，布鲁杆菌和多西环素对细胞凋亡的调控，与CALR和JNK信号通路之间又有怎样的关系？作者将在这篇文章中给出答案。

2021年4月28日，宁夏医科大学总医院神经内科王振海教授团队在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 上发表了题为 “Doxycycline Induces Apoptosis of Brucella Suis S2 Strain-Infected HMC3 Microglial Cells by Activating Calreticulin-Dependent JNK/p53 Signaling Pathway” 的研究论文，证实布鲁杆菌S2株通过诱导CALR蛋白表达，抑制JNK/p53信号通路，抑制HMC3细胞凋亡；DOX则通过抑制CALR蛋白表达，激活JNK/p53信号通路，进而诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡。王钊博士为论文第一作者，王振海教授为论文通讯作者。

为了研究CALR对p-JNK的影响，作者分别构建了CALR-NC-ZsGreen（CALR-NC）、CALR-ZsGreen（CALR）、sh-NC-ZsGreen（sh-NC）和sh-CALR-ZsGreen（sh-CALR）HMC3细胞系（图1A）。通过RT-qPCR法和western blot法检测各细胞系CALR mRNA（图1B）和蛋白质（图1C,D）水平，证实CALR过表达（CALR-ZsGreen）和敲减（sh-CALR-ZsGreen）细胞系构建成功。接着，作者通过western blot法检测各组p-JNK和p-p53蛋白水平（图1E），发现CALR组p-JNK和p-p53蛋白水平显著降低，而在sh-CALR组中这两种蛋白水平显著增加（图 1F,G）。为进一步探讨CALR对HMC3细胞凋亡的影响，又通过流式细胞术（图1I）发现CALR组细胞凋亡率较各组均降低，而sh-CALR组细胞凋亡率较各组均增加（图1H）。综上可知，CALR蛋白下调p-JNK和p-p53蛋白水平，从而抑制HMC3细胞的凋亡。

图1 CALR通过降低p-JNK和p-p53蛋白水平抑制HMC3细胞凋亡

（图源：Wang Z et al., Front Cell Infect Mi, 2021）

为了进一步证明布鲁杆菌S2株通过CALR蛋白调控JNK/p53信号通路影响HMC3细胞凋亡，作者用菌分别侵染各细胞系。采用western blot法检测CALR、p-ASK1、p-MEK4和p-JNK 蛋白水平（图2A,C），发现布鲁杆菌S2株能诱导CALR蛋白表达（图2B），同时降低p-ASK1、p-MEK4和p-JNK 蛋白水平（图2D-F）。众所周知，p-JNK能易位到细胞核并通过激活促凋亡基因诱导细胞凋亡[20]。作者采用免疫荧光技术检测各组细胞p-JNK蛋白核转运情况，发现布鲁杆菌S2株能抑制p-JNK蛋白核转运（图2G）。又通过western blot法证实该菌能降低p-p53这一凋亡蛋白水平（图2H,I）。此外，流式细胞术结果表明该菌亦能明显抑制HMC3细胞凋亡（图2J,K）。这些结果提示，布鲁杆菌S2株通过诱导CALR蛋白表达抑制JNK/p53信号通路，进而抑制HMC3细胞凋亡。

图2 布鲁杆菌S2株通过诱导CALR蛋白表达抑制JNK/p53信号通路依赖的HMC3细胞凋亡

（图源：Wang Z et al., Front Cell Infect Mi, 2021）

以前述实验为基础，作者进一步研究了DOX对布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡的作用。随即用布鲁杆菌S2株单独侵染HMC3细胞2 h或14 h；160 μm DOX单独处理HMC3细胞12 h；布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞2 h后，用160 μm Dox干预12 h。各组细胞CALR蛋白水平和JNK/p53信号通路相关的磷酸化蛋白通过western blot法测定（图3A,C），发现Dox能显著抑制布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞中CALR蛋白表达（图3B），同时增加了p-ASK1、p-MEK4和p-JNK蛋白水平（图3D-F）。作者再次通过免疫荧光技术检测各组细胞p-JNK蛋白核易位，显示DOX促进了感染细胞p-JNK蛋白核转运（图3G）。Western blot分析还表明Dox同时增加了感染细胞p-p53蛋白水平（图3H,I）。作者由此猜想，DOX能诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡。流式细胞术结果亦证实这一猜想（图3J,K）。由上可知，DOX通过抑制CALR蛋白表达，激活JNK/p53信号通路，进一步诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡。

图3 DOX诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡

（图源：Wang Z et al., Front Cell Infect Mi, 2021）

图4 工作总结图：DOX诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡机制图

（图源：王振海团队）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，本研究不仅证实布鲁杆菌S2株通过诱导CALR蛋白表达抑制JNK/p53信号通路，进一步抑制HMC3细胞凋亡，也证实了DOX通过抑制CALR蛋白表达激活JNK/p53信号通路，诱导布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡（图4）。此外，作者通过实验亦发现布鲁杆菌S2株对DOX诱导的HMC3细胞凋亡也有抑制作用。这些发现有助于为神经型布鲁杆菌病的药物治疗提供新靶点，并为该病临床治疗新方法的开发提供实验依据。

当然，这项研究也存在一些不足。比如，由于实验室生物安全级别的限制，作者目前只能开展细胞水平的研究，这距离将研究成果进行临床转化还有一大截差距。再有，作者虽然找到了DOX调节的蛋白，但是和DOX相结合的位点是哪些，这个还不清楚，这也将会作为作者后续的研究问题，争取为神经型布鲁杆菌病的精准治疗提供实验依据。

总之，神经型布鲁杆菌病的发病及干预机制还有待医学研究人员和临床工作者共同努力。相信在不久的将来，对这一疾病的治愈将不在话下，归还患者健康体魄和高质量的生活指日可待！

原文链接： https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2021.640847/full

第一作者王钊（左），通讯作者王振海（右）

（照片提供自：王振海实验室）

本研究受国家自然科学基金（编号：31660030、81960233）和宁夏回族自治区研发计划重大（重点）项目（编号：2018BFG02017、2019BCG01003）资助。感谢宁夏医科大学总医院临床病原微生物重点实验室，宁夏医科大学医学科学技术研究中心流式细胞室、激光共聚焦室为本研究提供平台支持。

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作者及实验室简介（上下滑动阅读）  

第一作者简介：王钊，空军军医大学临床医学专业在站博士后，助理研究员，医师。博士后研究方向：帕金森病的发病机制及干预。硕、博士导师均为宁夏医科大学总医院神经内科王振海教授，研究方向：神经型布鲁杆菌病的发病机制。邮箱：[e-mail]

通讯作者简介：王振海，医学博士、临床医学博士后，主任医师，二级教授，博（硕）士研究生导师。研究方向：1、中枢神经系统感染；2、脑血管病。现任宁夏医科大学总医院副院长、宁夏神经系统疾病诊疗工程技术研究中心主任。获“中国医师协会杰出神经内科医师学术成就”荣誉称号；享受国务院政府特殊津贴；国家自然科学基金和中国博士后基金等项目评审专家。主持国家级与省部级项目9项。以通讯作者或第一作者在《新英格兰医学杂志》 （NEJM）、Front Cell Infect Mi、Neurochem Res、Sci Rep等国内外期刊发表学术论文80余篇，单篇最高影响因子91.245。邮箱：[e-mail]

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参考文献（上下滑动阅读）  

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制版︱王思珍

本文完