Front Mol Neurosci︱季秋虹等发现急性脑缺血引起sEVs中脑特异性miRNAs的增加，助力脑卒中早期诊断
撰文︱周 心
责编︱王思珍
脑卒中（ stroke）是全球第二位致死原因，中国成人致死、致残的首位病因。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是卒中的主要类型，约占卒中总发病的80%[1]。寻找可用于IS早期诊断、预后评估的生物标志物对改善IS患者的临床诊疗具有重要价值[2, 3]。
miRNA是一类长度约为18-22个核苷酸的非编码RNA，在转录后水平调控基因的表达[4]。miRNAs存在于多种体液中[5]。由于miRNAs的相对组织特异性及在体液中的稳定性，是生物标志物研究的理想对象。小胞外囊泡（Small extracellular vesicles，sEVs）是几乎所有细胞类型都分泌的一类纳米囊泡，也是体液miRNA的主要存在形式[6, 7]。近来，包括作者在内的多个课题组报道了多种潜在的可用于IS诊断的sEV miRNAs，包括miR-9和miR-124 [8], miR-223 [9]、miR-422a和miR-125b-2-3p [10]、miR-21-5p和miR-30a-5p [11]、以及miR-17家族成员[12]。血清sEVs包含上千种miRNAs[13, 14]，但目前对急性脑缺血损伤对血清sEVs miRNA表达谱的影响尚不清楚。
2022年4月27日，南通大学附属医院季秋虹团队在Frontiers in Molecular Neuroscience上发表了题为“Acute Cerebral Ischemia Increases a Set of Brain-Specific miRNAs in Serum Small Extracellular Vesicles”的研究论文。通过small RNA测序，作者发现无论是IS患者还是短暂大脑中动脉闭塞模型小鼠的血清sEVs中一组脑特异性miRNAs的表达均显著增加。进一步的动物实验表明，这些血清sEVs中miRNAs的表达水平与脑缺血损伤的发生、发展和恢复过程密切相关，且这些miRNAs的表达不受神经炎症的影响。上述结果提示脑特异性的sEVs miRNA是潜在的可特异性反映脑缺血损伤的生物标志物。
考虑到有限的人和小鼠血清体积以及超离心分离sEVs的得率较低，作者选择了基于沉淀的ExoQuick方法分离血清sEVs[8, 15]。透射电镜、NTA（nanoparticle-tracking analysis）和WB分析表明，分离的人和C57BL/6小鼠血清中获得的颗粒符合sEVs的特性（图1和2）[16]。
图1 人血清sEVs的鉴定
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
图2 小鼠血清sEVs的鉴定
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
由于人血清sEVs中的RNA含量非常低[14]。为了获得足够的外泌体RNA用于小RNA测序，该研究将40例IS患者和33例健康对照（HC）随机分为两组，分别包括20例IS患者和17例HC，20例IS患者和16例HC。将每人200 μL血清混合，剩余样本用于后续PCR验证。该研究从2ml人血清中提取sEVs。Bioanalzyer分析结果显示，缺血性卒中显著增加血清外泌体RNA的数量（29±11 ng/mL（HC）vs 112±26 ng/mL（IS），p < 0.05）（图3 A, B）。
该研究从两个HC组中分别鉴定了1084和990种miRNAs，在两个IS组中分别鉴定了1113和1021种miRNAs。这些分析鉴定了1444个miRNAs，占已知人类miRNAs的54.2%。差异表达分析显示，与HC组相比，IS组中分别有208个和216个miRNAs上调和下调，占已鉴定miRNAs总数的29.4%。值得注意的是，这些差异miRNAs都是低丰度miRNAs，因为这些miRNAs的reads之和只占reads总数的不到1%。下调的miRNAs中，miR-122-5p是最丰富的miRNA。考虑到PCR在分析低丰度miRNAs的技术限制，作者主要关注前25种差异miRNAs，这些miRNAs的reads总数占表达增加miRNAs的85%。
图3 Bioanalyzer分析IS和HC，tMCAO和sham组血清sEVs中small RNA的长度分布和相对丰度
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了确定急性脑缺血对小鼠血清sEVs miRNA表达谱的影响，作者建立了60 分钟短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠模型。小鼠的梗死体积约为50%（图4），符合该IS动物模型的典型特征。将7 ~ 9只tMCAO小鼠的血清进行混合，假手术组小鼠血清也做同样处理。用500 μL的小鼠血清进行small RNA测序。与在IS患者中所观察到现象类似，与Sham相比，tMCAO小鼠血清sev中RNA含量增加，但两组间无统计学差异（图3 C,D）。
两个独立实验中，tMCAO组分别鉴定到1038和1074个miRNAs, Sham组分别鉴定到739个和864个miRNAs。两次分析共鉴定到1373种miRNAs, 占已知miRNA的71.7%。与Sham组相比，tMCAO组上调的miRNAs有20种，下调的有17种。与在IS患者中发现的一致，miR-122-5p也是含量最高的下调miRNA。
图4 小鼠tMCAO模型.
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
组织特异性是生物标志物的一个重要特征。基于先前报道的组织特异性miRNA信息 [12-14]，作者发现，IS患者血清sEVs前25种上调的miRNAs中包含5种脑特异性miRNAs：hsa-miR-9-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-98-5p、和hsa-miR-93-5p。类似地，在tMCAO小鼠血清sEVs中上调的20种miRNAs中，有9种脑特异性或在脑组织中高表达的miRNA：mmu-miR-124-3p、mmu-miR-9-3p、mmu-miR-9-5p、 mmu-miR-323-3p、mmu-miR-219b-5p、mmu-miR-129b-3p、mmu-miR-129-5p、mmu-miR-433-3p和mmu-miR-128-3p。IS患者和tMCAO小鼠的血清sEVs中一组脑特异性miRNA的一致上调也提示了一种保守的调节机制。
为了验证Small RNAseq识别的过表达的脑特异性miRNA，作者通过qRT-PCR检测了4种脑特异性miRNA，即hsa- miR -9-3p、hsa -miR-124-3p、hsa -miR-143-3p和hsa -miR-93-5p，在每个IS患者血清样本中的相对表达量。与small RNAseq结果的趋势一致，在IS患者血清sEVs中，这四种miRNAs的水平均显著升高，其中miR-9-3p的增加最为显著（图5）。
图5 qRT-PCR验证IS患者血清sEVs中四种上调的脑特异性miRNA
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了探讨脑缺血后血清sEVs中脑特异性miRNA增加所反映的可能的生物学意义，作者在tMCAO小鼠模型中检测了缺血后不同时间mmu-miR-124-3p、mmu-miR-9-5p、mmu-miR-129-5p和mmu-miR-433-3p的动态变化。结果显示，这4种miRNAs具有相似的表达模式：它们的表达在缺血后12小时开始增加，在第1天或第3天达到峰值，在第7天和第14天恢复至正常水平（图6）。提示这些血清sEVs中脑特异性miRNA表达的变化与脑缺血损伤的发生、发展和恢复过程密切相关。
图6 缺血再灌注后不同时间 tMCAO小鼠血清sEVs中脑特异性miRNAs表达的变化
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了探讨这些脑特异性sEVs miRNA是否可以区分脑缺血损伤与其他神经系统疾病，作者建立了脂多糖（LPS）诱导的小鼠神经炎症模型，并检测了9种脑特异性或脑组织高表达miRNA在LPS刺激小鼠血清sEVs中的表达。参与炎症应答的3个标志miRNAs（miRNA-181a-5p 、miRNA-146a-5p和miRNA-223-5p [22, 23]）作为阳性对照。与对照组相比，LPS刺激小鼠的血清sEVs中与炎症相关的3种miRNA的表达均显著增加，尤其是miR-223-5p。然而，除miR-128-3p外，LPS对其他8种脑特异性或脑组织高表达miRNA的表达无显著影响（图7）。上述结果提示，血清sEVs中的这些脑特异性miRNAs的增加可以特异性反映脑缺血损伤。
图7 LPS处理对小鼠血清sEVs中脑特异性miRNAs表达的影响
（图源：Zhou X, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
原文链接： https://doi.org/10.3389/fnmol.2022.874903
上述研究工作得到国家自然科学基金国际合作项目（81761128018）、国家自然科学基金面上项目（82071553, 81572871,81201016, 81272027）等资助。
季秋虹教授
（照片提供自：南通大学附属医院季秋虹团队）
季秋虹，教授，博导，美国斯坦福大学访问学者。从事脑血管病临床与基础研究，发表SCI论文20余篇，获得多项发明专利授权。主持国家自然科学基金2项，参与多项国家及省部级课题。
【1】Sci Adv︱孔庆鹏/李吉/蔡望伟合作揭示人类健康老化的新型机制：转录因子ETS1调控的核糖体功能降低
【2】STAR Protocols︱秀丽线虫胚胎后发育过程的荧光活体成像方案
【3】Mol Psychiatry︱胡少华/宋学勤/聂超团队在双相障碍的脑肠轴机制研究取得新进展
【4】Neurosci Biobehav Rev 综述︱二型糖尿病相关认知功能障碍的研究进展：潜在的机制和治疗方法
【5】Neurosci Biobehav Rev︱毕鸿燕课题组揭示不同书写系统阅读障碍儿童神经机制的异同
【6】Neuron︱陈涛/李云庆/卓敏课题组合作揭示疼痛共情的突触和分子机制
【7】Transl Psychiatry︱李燕/张婕团队首次将经皮穴位电刺激用于治疗学龄期儿童注意缺陷多动障碍
【8】Aging Cell 综述︱张宏/陈颖志/田梅合作评述肠道菌群调节小胶质细胞功能参与认知老化的作用机制
【1】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会 5月21-22日 腾讯会议
参考文献（上下滑动阅读）
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制版︱王思珍
本文完