J Neurosci︱陈婷婷课题组揭示Ras抑制剂Lonafarnib对Aβ1-42小鼠突触结构和功能的改善及其分子机制

撰文︱王立凤

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，作为一种复杂的多因素疾病，治疗AD的有效药物仍然知之甚少。AD具有学习和记忆缺陷的特征，这与海马区突触的结构和功能损伤密切相关[1]，如突触的丢失[2]、神经元形态[3]和突触蛋白的改变[4]，进而破坏了突触的传递和可塑性[5]。突触缺陷是该病症认知功能障碍的病理学基础，深入认识突触结构和功能缺陷导致认知功能障碍的机制可为AD患者“突触疾病”[1]的治疗提供了新的思路和靶点，对AD治疗的发展具有重要意义。

Ras蛋白是小G蛋白超家族的一种，主要参与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导和记忆的形成等。据报道，AD患者的大脑中存在Ras的过度表达[6]。Ras信号通路与突触功能和记忆密切相关[7]，Ras在神经纤维瘤小鼠中的过度表达显著损害了认知记忆和突触功能[8]。然而Ras抑制是否能挽救AD小鼠突触的功能或结构损伤尚不清楚。

近期，南通大学的陈婷婷团队在Journal of Neurosciencence上发表了题为“Ras Inhibitor Lonafarnib Rescues Structural and Functional Impairments of Synapses of Aβ_1-42 Mice via α7nAChR-Dependent BDNF Upregulation”的文章，阐述了在AD模型Aβ_1-42小鼠中Ras抑制剂Lonafarnib如何与突触结构和功能联系起来。讲师蔡成云、研究生王立凤和李世鑫为共同第一作者，陈婷婷副教授为通讯作者。在此项研究中，作者发现并证明了Lonafarnib可以挽救Aβ_1-42小鼠突触的结构和功能损伤，改善空间认知能力，这与Lonafarnib通过H-Ras-α7nAChR依赖的CaMKⅡ-CREB途径增加脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）含量密切相关。

Aβ（β-amyloid）是存在于AD患者大脑中老年斑的主要成分[9]。Aβ在脑内的聚集在AD的发病机制中起主要作用[10]。研究人员首先利用外源性Aβ_1-42诱导出Aβ聚集的AD病理特征以及空间记忆障碍表型（图1A-C）。研究发现Ras靶向抑制剂Lonafarnib以剂量依赖性方式挽救Aβ_1-42诱导的空间记忆障碍，50 mg/kg为合理有效剂量（图1D&E）。

图1 Lonafarnib以剂量依赖的方式改善了Aβ_1-42小鼠的空间学习记忆

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

为了进一步探讨Lonafarnib挽救空间认知的机制，对各组小鼠的突触功能进行检测，研究表明，Lonafarnib挽救了Aβ_1-42小鼠的突触传递（图2A），突触前递质释放（图2B）和可塑性缺陷（图2C-E），提高了对照小鼠的突触可塑性，但对对照小鼠的突触传递没有影响。

图2 Lonafarnib增强了Aβ_1-42小鼠和对照组小鼠的突触功能

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

突触形态及神经元结构变化可能影响突触功能[11-12]。为了进一步探讨Lonafarnib对Aβ_1-42鼠突触功能的改善是否与其结构变化有关。研究人员对海马CA1区进行高尔基染色，检测Aβ_1-42小鼠神经元形态和树突棘密度。结果表明，Lonafarnib治疗可以改善Aβ_1-42小鼠受损的突触形态，包括树突长度（图3A）、分支数量（图3B）、离胞体不同距离的树突复杂性（图3C）以及树突棘密度（图3D）；但对对照鼠没有影响。

图3 Lonafarnib改善Aβ_1-42小鼠树突和棘的形态

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

突触前标志物Syn和突触后标志物PSD-95是突触发生的重要标志，在突触可塑性中发挥着重要作用[13]。作者进一步使用免疫荧光染色检测Syn和PSD-95的表达，旨在探索可能与树突和棘改变相关的突触数量的变化。研究发现，与对照组相比，Aβ_1-42小鼠的PSD-95（图4A&C）和Syn（图4B&D）阳性面积分数均减少，阳性斑点数（图4A&E，图4B&F）也减少。Lonafarnib可以恢复Aβ_1-42小鼠中突触蛋白的减少，但在对照小鼠中没有这种作用。表明Lonafarnib治疗后的Aβ_1-42小鼠突触可塑性和形态学的改善伴随着突触数量的提高。

图4 Lonafarnib改善Aβ_1-42小鼠突触数量

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

接下来研究者对Lonafarnib改善AD模型鼠突触功能和结构的分子机制进行探究。BDNF是分布最广、研究最多的神经营养因子之一，也是调节神经元间突触功能和结构的主要因子[14]，对突触形态和功能调节至关重要。而BDNF的表达与α7nAChR密切相关[15-16]。该课题组前期的研究已经发现了Lonafarnib在对照鼠中可以增强α7nAChR的功能活性和表达[17-19]。基于这些，作者假设Lonafarnib是否是作用于α7nAChR使BDNF上调，从而调节AD鼠的突触结构和功能。

实验结果表明，Aβ_1-42小鼠中α7nAChR的细胞膜表达显著降低，而Lonafarnib治疗可逆转这一现象。且Lonafarnib引起的Aβ_1-42小鼠Akt和CaMKII活性改变与α7nAChR有关（图5B&D），但在该实验模型中Lonafarnib对ERK信号通路没有明显影响（图5C）。Lonafarnib引起的Aβ_1-42小鼠CREB的活性增强与ERK和CaMKⅡ信号通路有关（图5E&F）。结合图C，结果表明Lonafarnib是通过CaMKⅡ通路而改善Aβ_1-42小鼠的CREB活性。Lonafarnib治疗可以逆转Aβ_1-42小鼠中BDNF含量的降低，且与α7nAChR和CaMKⅡ信号通路密切相关（图5G&H）。综上，Lonafarnib确实可以上调Aβ_1-42小鼠的BDNF分泌表达，并且是和α7nAChR-CaMKⅡ-CREB信号通路密切相关。

图5 Lonafarnib通过α7nAChR依赖的途径增加了Aβ_1-42小鼠海马BDNF的含量

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

先前研究表明Lonafarnib主要通过抑制法尼基转移酶发挥作用，其更有效并强效抑制H-Ras的异戊二烯化进而影响其活化，但不抑制K-或N-Ras的异戊二烯化，因为这些蛋白质可以被GGTaseⅠ酶修饰[20-21]。除Ras抑制是直接作用外，Lonafarnib还可以通过靶向Rhes诱导溶酶体介导的tau降解并预防tau小鼠的病理[22]。为了确定Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠中α7nAChR或BDNF的影响与H-Ras还是Rhes有关，作者采用腺相关病毒构建H-Ras和Rhes过表达小鼠（图6A&B）。结果表明，H-Ras而非Rhes过表达可以在对照鼠中模拟出α7nAChR膜表达和BDNF含量的降低，这两者都被Lonafarnib增强（图6C&D）。作者还在Lonafarnib治疗14天后的Aβ_1-42小鼠中构建H-Ras和Rhes过表达，如图G&H所示，Lonafarnib增强的α7nAChR膜表达和BDNF含量均被H-Ras过表达显著抑制，但不受Rhes过表达的影响。以上结果表明，Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠的α7nAChR膜表达、BDNF含量和BDNF相关突触功能的改善与H-Ras而不是Rhes有关。

图6 H-Ras而非Rhes参与了Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠中α7nAChR和BDNF的影响

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

最后，作者使用BDNF剥夺剂Fc预处理小鼠来验证Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠突触和认知功能的改善是否确实通过BDNF的增加来起效。结果显示，用Fc预处理显著消除了Lonafarnib诱导的突触功能（图7A-D）以及空间记忆的改善（图7E&F）。以上结果说明Lonafarnib引起的突触和认知功能的改善确实与BDNF的增强作用有关。

图7 BDNF剥夺逆转了Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠空间记忆的有益影响

（图源：Cai C, et al., J Neurosci, 2022）

图8 论文总结图

（图源：南通大学药学院陈婷婷课题组）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究利用C57BL6/J小鼠为研究对象，采用脑室注射Aβ_1-42制备AD模型，通过对脑室注射有关抑制剂以及对海马注射相关蛋白的病毒表达载体，结合电生理、高尔基染色、免疫荧光染色、免疫印迹及行为学等技术，研究Ras靶向抑制剂Lonafarnib对Aβ_1-42小鼠突触结构和功能的改善及其分子机制。该课题首次并创新性地提出并验证了Ras靶向抑制剂Lonafarnib可通过抑制H-Ras活化而增强α7nAChR相关的BDNF功能，由此改善AD小鼠突触结构和功能的缺陷、改善认知，并进一步阐明了其内在分子机制，为AD突触功能缺陷治疗提供新的思路和靶点，为治疗AD患者的“突触疾病”提供了新的认识和有效的途径（图8）。当然，这项研究还存在一些有待解决的问题，比如尚未对导致突触形态改变的具体分子机制进行研究、在其他痴呆模型中是否适用等。

原文链接：https://www.jneurosci.org/content/early/2022/06/24/JNEUROSCI.1989-21.2022

南通大学讲师蔡成云、研究生王立凤、李世鑫为共同第一作者，南通大学陈婷婷副教授为通讯作者。该项工作获得国家自然科学基金项目（81901098、82001417、82070600）以及江苏省自然科学基金资助项目（BK201909923、BK20200966、BK20200972）资助。

通讯作者陈婷婷（左一）；共同第一作者蔡成云（左二）、王立凤（右二）、李世鑫（右一）

（照片提供自：南通大学陈婷婷团队）

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本文完