J Neuroinflammation︱曹嵩课题组揭示激活蓝斑-脊髓去甲肾上腺素能神经元通过减少脊髓背角神经炎症缓解小鼠疼痛

撰文︱李隽，曹嵩

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是指由躯体感觉系统[1]的创伤或疾病引起的疼痛。NP的发病机制复杂，临床上仍缺乏有效的镇痛药[2]。因此，NP有时会长期严重影响患者的生活质量。

蓝斑（locus coeruleus，LC）是一个重要的去肾上腺素能核团[3]。蓝斑-脊髓去甲肾上腺素能通路（LC:SC）是最重要的疼痛抑制通路之一[4, 5]，参与疼痛的调节，包括NP[6]。LC将下行纤维投射到脊髓背角（spinal dorsal horn，SDH），释放去甲肾上腺素（orepinephrine，NE）抑制疼痛信号的上升。该通路对生理性疼痛无明显抑制作用，但在病理条件下，释放到SDH的NE增加，可显著抑制病理性疼痛[7]的传递。虽然有报道选择性激活LC:SC去肾上腺素能通路可增加NP大鼠[6]的疼痛阈值，但LC:SC激活是否能缓解NP、减少神经炎症反应尚不清楚，其具体的细胞和分子机制仍不清楚。

近期，遵义医科大学的曹嵩课题组在《神经炎症杂志》（Journal of Neuroinflammation）上发表了题为“Activation of locus coeruleus-spinal cord noradrenergic neurons alleviates neuropathic pain in mice via reducing neuroinflammation from astrocytes and microglia in spinal dorsal horn”的研究论文。此项研究揭示了通过激活蓝斑-脊髓去甲肾上腺素能通路通过增加脊髓NE含量从而缓解神经病理性疼痛。在本研究中，NE可能通过作用于胶质细胞的α2AR来抑制炎性细胞因子的释放，也可能通过激活WDR神经元的α2AR来抑制其兴奋性传入从而缓解疼痛。

为了选择性激活LC:SC通路，作者使用了Gq-DREADD（Gq -偶联受体，hM3Dq）及其配体CNO。为了使Gq-DREADD受体在LC TH表达神经元中过表达，将病毒（TH-nls-cre- AAV2/retro, Efla-DIOh M3Dq-mCherry或Efla-DIO-mCherry）分别注射到SDH（L3-L5）和LC中，而腹腔注射CNO保证了LC:SC通路的选择性激活。注射病毒3周后检测LC神经元中M3的表达。术后3周对LC神经元的峰电位进行体内胞外记录（图1A, B）。

免疫荧光切片显示，在LC尾部，逆行AAV可以转染更多的TH1阳性神经元（图1C）。结果表明，LC中去甲肾上腺素能神经元成功转染，M3受体在去甲肾上腺素能神经元中表达，主要集中在LC的腹侧和尾侧(图1C）。

记录LC神经元放电后，腹腔注射CNO。约5 min后，LC神经元的放电频率逐渐增加（图1D, E）。坐骨神经慢性压迫模型(chronic constriction injury，CCI)不影响LC神经元的基线放电频率（图1G）。与基线相比，腹腔注射CNO后LC神经元放电频率增加（图1F, H）， Gq-DREADD激活LC:SC后SDH NE含量增加（图1I）。这些结果表明M3 Gq-DREADD可以激活LC NE神经元。

图1 在体化学遗传法激活蓝斑神经元

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

注射AAV后3周建立CCI模型，术后1-2周检测小鼠疼痛阈值（图2A、B）。直到术后第14天，疼痛阈值水平一直很低(图2C, D）。这些数据表明，术后第7天CCI导致NP。与CCI + M3 + CNO +Saline组比较，CCI + M3 + CNO +Yohimbine组小鼠机械痛阈和热痛觉痛阈显著降低（图2E, F）。提示LC:SC的激活可以减轻CCI小鼠的痛觉过敏反应。

图2 激活LC:SC可以减少CCI小鼠的痛觉过敏

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了研究LC:SC的化学发生激活是否减少了诱导的疼痛传递，作者记录神经损伤同侧脊髓电生理记录。结果显示，随着小鼠足底刺激的增加，WDR神经元的放电频率逐渐增加（图3C）。

WDR神经元编码刺激强度，对无害和有害的刺激都有反应。WDR的平均自发放电频率为5.08±0.29 Hz，经后足底轻夹刺激后增加到25.02±1.18 Hz（图3D, G）。在转染LC:SC的动物中，CNO（3 mg/ kg)的应用可逆地减弱WDR神经元对所有刺激的反应，而同时灌注育亨宾（0.1 μg/kg [6]）（图3C-G）可阻断这种反应。这些数据表明，在CCI小鼠中激活LC:SC可引起α2-肾上腺素能受体介导的WDR神经元对无害和有害刺激的反应抑制。

图3 LC:SC的激活可抑制CCI小鼠WDR神经元的放电频率

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

为探讨LC:SC的化学发生性激活是否能降低NP，在LC:SC激活1周后检测NE水平，并在LC:SC激活3天后评估CCI小鼠的疼痛阈值。ELISA法测定小鼠脊髓背侧NE含量。与CCI + M3 +Saline组相比，CCI + M3 + CNO组NE含量增加。结果显示，化学发生激活LC:SC可增加NE水平（图4C）。

在LC:SC激活3天后，长期的LC:SC激活也会降低NP（图4D, E）。这种作用被鞘内注射育亨宾（1 mg/ml，5 μl）（图4D, E）所阻断。这些数据表明，在CCI小鼠中，LC:SC的激活会引起α2-肾上腺素能受体介导的痛觉过敏抑制。

LC:SC激活一周可抑制SDH中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，采用免疫荧光法观察SDH（L3-L5）中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况。与Sham组相比，cci 同侧SDH中激活的小胶质细胞和星形胶质细胞更多（图5A-C）。

LC:SC激活1周后，与CCI + M3 +Saline组相比，CCI + M3 + CNO组星形胶质细胞和小胶质细胞的活化明显降低。与CCI + M3 + CNO +Saline组比较，CCI + M3 + CNO +Yohimbine组星形胶质细胞和小胶质细胞的活化增加（图5D-F）。

图4 LC:SC激活一周会增加SDH的NE并缓解NP

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

图5 LC:SC激活一周可抑制SDH中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

考虑到LC:SC的激活可以抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，为了评估LC:SC的抗神经炎症作用，我们在长期（7天）LC:SC激活后检测了几种胶质细胞相关的细胞因子。与Sham组比较，CCI组SDH中TNF-α、IL-1β表达上调。与CCI + M3 +Saline组相比，CCI + M3 + CNO组TNF-α、IL-1β表达下调（图6A、B）。PCR检测SDH的神经炎症反应。结果显示，与CCI + M3 + CNO +Saline组相比，CCI + M3 + CNO +Yohimbine组的促炎细胞因子表达被Yohimbine逆转（图6C-H）。CCI + M3 + CNO + Yohimbine组与CCI + M3 + CNO组相比，抗炎细胞因子表达降低（图6I-L）。

图6 LC:SC的激活促进SDH抗炎细胞因子表达，抑制促炎细胞因子

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

采用免疫荧光法观察炎症细胞因子和胶质细胞标志物（IBA1或GFAP）的共同标记。结果显示TNF-α和IL-1β均与小胶质细胞的数量和活化呈正相关（图7A, B）。与CCI + M3 +Saline组相比，CCI + M3 + CNO组TNF-α和IBA1共定位降低，并可被Yohimbine逆转（图7C）。与Sham组相比，CCI组IL-1β和IBA1共定位的相对数量和百分比均增加。

图7 在SDH中TNF-α、IL-1β与IBA1共表达

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

与CCI + M3 +Saline组相比，CCI + M3 + CNO组IL-1β和IBA1共定位降低，Yohimbine可逆转这一现象（图7E, F）。然而，TNF-α和IL-1β都不能很好的与星形胶质细胞共表达，这表明CCI后脊髓的炎症因子并不是主要由星形胶质细胞产生的（图8）。

图8 在SDH中TNF-α、IL-1β与GFAP共表达

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

由于Yohimbine可以逆转LC激活的镇痛作用并抑制神经炎症，为了进一步评估NE作用于哪类细胞上的α2AR，我们利用免疫荧光技术观察了CCI小鼠脊髓（L3-5）中α2A-AR和α2B-AR的表达。结果表明, α2A-AR在小胶质细胞和星形胶质细胞低表达（图9）。此外,α2B-AR高度表达于小胶质细胞，低表达于星形胶质细胞。

图9 SDH中α2-AR的表达

（图源：Li J, et al., J Neuroinflammation, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究采用了坐骨神经慢性压迫模型（CCI）这一经典的神经病理性疼痛模型，通过化学遗传法、q-PCR、ELISA和免疫荧光技术发现了激活蓝斑-脊髓去甲肾上腺素能通路增加脊髓背角NE含量，NE通过作用于胶质细胞的α2AR来抑制炎性细胞因子的释放，也可能通过激活WDR神经元的α2AR来抑制其兴奋性传入从而缓解疼痛。当然，这项研究还存在一些有待解决的问题，比如，在该研究中，虽然观察到NP小鼠LC:SC激活后SDH中NE含量增加，小胶质细胞和星形胶质细胞活化降低，但并不能证明NE直接作用于SDH胶质细胞抑制其活化。总之，此研究揭示了NE在脊髓背角缓解NP作用机制，为治疗神经病理性疼痛提供另一种思路。

共同第一作者李隽（左）、魏义勇（中）、周俊丽（右）以及通讯作者曹嵩

(照片提供自：遵义医科大学曹嵩课题组)

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完