Nat Neurosci︱突破！钾通道视紫红质是介导光遗传学抑制的天然光门控钾通道

撰文︱周  宁

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

钾（K⁺）通道普遍存在于生命的所有领域。它们很容易通过高度保守的K⁺通道特征序列识别，该序列编码一个K⁺选择性过滤器，该过滤器强烈支持K⁺的电导而不是Na⁺。光敏感通道蛋白（Channelrhodopsin，ChR）是首次在莱茵衣藻中发现的光门控离子通道[1-3]。它们用于用光（光遗传学）操纵可兴奋动物细胞的膜电位。阳离子传导ChRs（CCRs）主要是质子通道，其中一些也能够传导金属阳离子[4]。CCRs的光激活使神经元膜去极化并刺激形成尖峰（spiking）。阴离子导电ChR（ACR）可传导卤化物和硝酸盐，并根据Cl^-的电化学电位产生超极化或去极化光电流[5]。ACR通过超极化电流抑制神经元的兴奋性，或者在Cl^-反转电位照射时通过分流抑制来抑制神经元的兴奋性。

K⁺电化学梯度的消散导致神经元中的膜超极化，这从而激励了科学家设计光门控K⁺通道。神经元K⁺通道已通过添加合成光开关或光活性蛋白结构域进行修饰，或通过与光敏腺苷酸环化酶共表达来间接控制[6-7]。这两种方法在某些应用中都有前景，但受限于缓慢的动力学和可能的cAMP诱导的副作用。K⁺是神经元电生理学的核心，但尚未发现天然的K⁺选择性光门控通道。

2022年6月20日，美国德克萨斯大学休斯顿麦戈文医学院健康科学中心的John L. Spudich团队在Nature Neuroscience上发表了题为“Kalium channelrhodopsins are natural light-gated potassium channels that mediate optogenetic inhibition”的技术报告文章（Technical Report），作者报告了来自链状丝孢菌的钾通道视紫红质（KCRs）。KCR与已知门控钾通道的不同之处在于它们是光门控的，并且已经独立进化出另一种K⁺选择性机制。 KCR对K⁺的选择性高于对Na⁺的选择性，并且在光活化后不到1毫秒内打开。作者还发现HcKCR1能够实现K⁺梯度的光遗传学控制，这对于钾离子通道病（如癫痫、帕金森病和长QT综合征和其他心律失常）的研究和潜在治疗具有重大意义。

在目前已知的ChRs中，KCR序列与隐芽植物藻类BCCRs的关系最为密切（图1）。然而，在迄今为止测试的15个在异源系统中起作用的BCCR中，没有一个表现出K⁺选择性。因此，KCRs可以被视为ChRs的一个单独的功能类别，因为它们具有独特的选择性。

图1 KcRs与其他已知chRs的种系发生关系

（图源：Elena G. Govorunova, et al., 2022）

作者首先合成了编码七螺旋跨膜（视紫红质）结构域的哺乳动物密码子适应版本的多核苷酸，并在其C端连接mCherry后表达于人胚胎肾（HEK293）细胞。然后检测了它们的光电流作用光谱（图2a）。由H. catenoides KCR1（HcKCR1）在生理离子条件下响应光照产生的一系列光电流如图2b所示。峰值电流的电压依赖性（IV曲线）显示出轻微的向内整流和-85±2 mV的反转电位（图2c, d），这种行为在任何先前的ChR中都没有观察到，这种现象只能用对K⁺对Na⁺的选择性来解释。HcKCR1表现出比HcKCR2更红移的光谱、更大的电流幅度和对K⁺的更高选择性。使用与上述Na⁺类似的程序，作者确定了其他金属阳离子和N-甲基-d-葡糖胺（NMDG⁺）的PX/PK比率（图2e）。

作者使用传统的双光子（2P）激光进行光栅扫描，以确定HcKCRs是否可以被2P照明激活。作者发现，2P诱发的光电流迹线（图2g）与在可见光范围内连续单光子（1P）照明下记录的相似（图2b）。在测试的最大功率下，峰值电流幅度没有饱和（图2h）。作者将激光波长在800和1080 nm之间变化，同时保持功率恒定，通过测量电流上升的斜率获得的2P作用光谱分别在HcKCR1和HcKCR2的~1,040和~990 nm处表现出最大值（图2i）。

图2 由连续光和2P激发引起的KCR光电流

（图源：Elena G. Govorunova, et al., Nat Neurosci, 2022）

ChR不适合单通道记录，但它们的单一电导可以通过平稳噪声分析来估计[8]。接着，作者又对HcKCR1进行了平稳噪声分析。与黑暗条件相比，从HcKCR1转染的细胞记录到的噪声在连续光照下增加（图3a）。明暗噪声的功率密度谱如图3b所示。采用洛伦兹函数（Lorentzian function）进行明暗差光谱拟合（图3c），并得出单一电导（γ）约为0.7 pS。

图3 HcKcR1单电导的测定

（图源：Elena G. Govorunova, et al., Nat Neurosci, 2022）

连续光的注量率不足以解决ChR分子内的快速电荷位移，但可以通过单周激光闪光来监测[9]。因此，作者接着使用6 ns激光闪光激发，监测被动通道通量和探测蛋白质内的电荷运动。作者发现无论离子梯度如何，通道电流都可以与三个指数拟合（图4a）。在所有实验条件下，三个动力学分量的振幅V_rev相同（图4b），表明相对渗透率在通道循环期间没有变化。在对称离子条件下（浴和移液管中的130 mM KCl），V_rev 仅微弱地依赖于pH（图4c），这证实了HcKCR1对在连续照明下检测到的质子的低渗透性（图2f）。

光活化的视紫红质通过一系列光谱不同的中间体经历一个化学转化循环，这些中间体通常命名为K、L、M和N/O。作者接着在毕赤酵母中表达了HcKCR1，并在非变性洗涤剂中对其进行了纯化。观察到其在430 nm处的吸光度随着395 nm处的增加而下降，这是从L样过渡到M样中间体的特征（图 4e）。作者通过在没有可渗透金属阳离子的情况下记录光电流来探测HcKCR1中的分子内电荷位移（图4f）。正峰的电压依赖性在有源电荷运动的大负值特征处穿过x轴（图4g）。当细胞外pH值变化超过4个单位（即 240 mV）时，这些值保持接近，表明光活性位点几乎不能被外部质子访问。无源通道电流和有源电荷转移都在最大M积累之前达到峰值，并在M减少的时间窗口中衰减（图 4h）。这一观察表明，席夫碱的再质子化至少部分发生在最初质子化的受体上，并且没有质子泵送穿过膜。有源电荷运动的衰减可以与τ = 65和420 ms的两个指数拟合（图 4f），或者与τ ~120 ms的单个指数拟合（图 4i）。

图4 单量子激发下的光电流和光化学转换

（图源：Elena G. Govorunova, et al., Nat Neurosci, 2022）

在对HEK293细胞中的HcKCR进行了表征之后，作者接下来确定了HcKCR在神经元中光遗传学沉默的适用性。作者在胚胎第14.5天或第15天通过宫内电穿孔技术将与EYFP 融合的HcKCR1或HcKCR2特异性地表达在小鼠体感皮层的2/3层锥体神经元中（图5a）。作者发现HcKCR1在绿光脉冲中产生强大的光电流（图 5b）。当膜被超极化时，1秒照射结束时的光电流幅度与峰值幅度的比率增加（图 5d）。IV曲线显示峰值光电流的反转电位为-63 mV，末端光电流的反转电位为-56 mV（图 5e-g），表明在连续光刺激下吸收第二个光子时形成的通道状态改变了相对渗透率有利于Na⁺。然后，作者对3到4周大的小鼠制备急性脑切片，并对表达HcKCR1或HcKCR2的神经元进行全细胞电压钳记录，以测试HcKCR1作为神经元沉默工具的有效性。作者发现，当膜电位处于静止状态时，HcKCR1的光活化在1秒照明结束时使膜去极化（图 5h）。这些结果表明光电流足以使膜电位达到HcKCR1的反转电位（图 5f,g）。而HcKCR1的光激活抑制了光照期间的所有动作电位（图5h, i），证明HcKCR1是小鼠皮质神经元的有效光遗传学抑制器。

图5 神经元中HcKCR1的光激活产生强大的光电流并有效抑制神经元放电

（图源：Elena G. Govorunova, et al., Nat Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现的HcKCR1使用天然K⁺选择性工具扩展了光遗传学工具箱，该工具能够直接、快速和有效地光控制小鼠皮层神经元中的K⁺跨膜梯度。它的主要优点是电流动力学比其他可用于操纵 K⁺ 梯度的光遗传学和光药物遗传学工具快1000倍。在长时间光照下（即在脱敏状态下）测量的HcKCR1的单一电导比其他CrChR2提高约20倍。两种KCR 都可以使用2P照明激活，并且两种KCR的2P光谱与神经科学实验室中使用的常见激光器的激发波长非常匹配，这有利于为它们在针对单个细胞或神经元过程的体内光遗传学沉默实验的使用。

但神经元中HcKCR的细胞内聚集，特别是在长期实验中可能会影响细胞健康。未来还需更多研究以测试是否是这种情况，以及额外的运输基序是否会减少细胞内聚集并改善HcKCR的膜靶向性。此外，由于2P光电流在最高测试激光功率下没有饱和，因此在未来的研究中可以实现更大的电流，或者使用更有效的照明方法。

原文链接：https://doi.org/10.1038/ s41593-022-01094-6

人才招聘
【1】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)

往期文章精选【1】Acta Neuropathol︱陈础课题组揭示创伤性脑损伤促进阿尔茨海默病发展的关键因子【2】Neurosci Biobehav Rev︱唐向东团队探索PTSD夜间梦魇的药物治疗与心理治疗疗效【3】Cell Biosci︱易立涛/朱继孝团队合作揭示IL-1R/C3aR通路调控抑郁症突触修剪的作用机制Neurosci 【4】Cereb Cortex︱王群/胡文瀚/王茜团队合作揭示受言语可懂度调控的两阶段听皮层加工机制【5】Mol Neurobiol︱刘振华课题组揭示DNAJ家族基因在帕金森病中的作用【6】Nat Neurosci︱表征研究突破！疼痛个体的大脑表征差异【7】Front Aging Neurosci︱樊东升团队聚焦NK细胞在帕金森病中的病理作用【8】Neurosci Bull︱郑芳课题组揭示星形胶质细胞来源的HMGB1在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的重要作用【9】J Neurosci︱叶冰研究组揭示大脑皮层增厚过程的分子机制【10】Sci Adv︱杨雄里院士团队揭示自感光视网膜神经节细胞在近视形成中的重要作用

优质科研培训课程推荐【1】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会 8月6-7日 腾讯会议

参考文献（上下滑动阅读） 

[1]  Sineshchekov, O. A., Jung, K.-H. & Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 8689–8694 (2002).

[2] Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science 296, 2395–2398 (2002).

[3]  Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cationselective membrane channel. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 13940–13945 (2003).

[4]  Sineshchekov, O. A., Govorunova, E. G., Li, H. & Spudich, J. L. Bacteriorhodopsin-like channelrhodopsins: alternative mechanism for control of cation conductance. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, E9512–E9519 (2017).

[5]  Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Liu, X., Janz, R. & Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: a family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science 349, 647–650 (2015).

[6]  Richards, R. & Dempski, R. E. Re-introduction of transmembrane serine residues reduce the minimum pore diameter of channelrhodopsin-2. PLoS One 7, e50018 (2012).

[7]  Beck, S. et al. Synthetic light-activated ion channels for optogenetic activation and inhibition. Front. Neurosci. 12, 643 (2018).[8]  Feldbauer, K. et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 12317–12322 (2009).
[9]  Sineshchekov, O. A., Govorunova, E. G., Wang, J., Li, H. & Spudich, J. L. Intramolecular proton transfer in channelrhodopsins. Biophys. J. 104, 807–817 (2013).

本文完