Nat Neurosci︱单细胞转录组学结合表面抗原检测揭示人脑癫痫病灶促炎信号通路激活

撰文︱郭  宇

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

癫痫（epilepsy），俗称“羊角风”，是一种常见的神经系统疾病，全世界大约有5000多万患者[1, 2]。癫痫最主要的临床特征为癫痫发作（recurrent unprovoked seizures），俗称“抽搐”。临床首选的抗癫痫发作药物主要通过降低神经元兴奋性或增加抑制性活动来控制癫痫发作。然而，大约三分之一的患者对抗癫痫药物产生抵抗作用，被称为药物难治性癫痫（drug-refractory epilepsy，DRE）。目前，DRE的研究和治疗进展十分缓慢，手术切除癫痫病灶脑组织是临床上常用的治疗手段，这往往会带来极大的副作用。因此，深入理解DRE的发生原理揭示其发生发展进程显得十分必要[3]，可能为发现新的高效的药物靶点和非侵入性治疗癫痫的发展提供可能的理论依据。

神经炎症被认为是癫痫发生发展的重要诱因[4]。已有研究报道，在癫痫动物模型和人类慢性癫痫患者脑组织中，在癫痫发作4h后，激活神经胶质细胞产生大量的炎性细胞因子[5]。此外，有研究人员在儿童癫痫患者脑组织中发现了CD4⁺、CD8⁺和分泌IL-17的γδ T细胞的浸润[6]。有意思的是，临床病例研究表明抗炎治疗对部分癫痫患者十分有效[7]。然而，目前关于耐药性癫痫的免疫机制的研究，仍知之甚少。

近日，新加坡国立大学-杜克医学中心转化医学免疫研究所Pavanish Kumar教授团队在Nature Neuroscience杂志上发表了题为“Single-cell transcriptomics and surface epitope detection in human brain epileptic lesions identifies pro-inflammatory signaling”的研究论文，首次发现人脑癫痫病灶中促炎信号通路被显著激活，基于配体受体交互分析证明了小胶质细胞和外周浸润T细胞之间的互作在癫痫的病理进程中发挥关键作用。

为了确定免疫机制是否影响癫痫发生，研究人员采用多模态单细胞技术CITE-seq对癫痫手术切除中获得的脑组织单细胞悬液进行了检测。使用10x Genomics Single Cell平台对来自6名患者的脑组织样本中分离的免疫细胞进行测序。数据质量控制后, 共保留了85780个细胞和22968个基因用于进一步分析。基于二维t分布的随机邻域嵌入（t-SNE）对各种细胞类型进行聚类、鉴定和分布展示（图1a）。使用基于图的Louvain聚类算法将细胞聚类成子集，得到26个聚类。基于CD45表达水平，13个集群（0-7、9-12和14）被鉴定为小胶质细胞亚群（CD45低表达）和6个集群（8、15 - 17、19和21）被鉴定为浸润性免疫细胞（CD45高表达）。其它所有CD45阴性的集群，通过标记基因表达水平进行鉴定：集群13、20和22（表达CLDN5、MYH11、ABCC9、VWF和ACTA2）被鉴定为神经血管细胞单元，而集群18（表达MAG和MOG）被鉴定为少突胶质细胞。在免疫细胞亚群中，集群19富含有B细胞标记蛋白（CD19和CD20）和集群17富含有巨噬细胞标志物蛋白（CD45^hi、CD14、CD11b)。集群8、15和16被鉴定为T细胞亚群（CD45^hiCD3⁺）（图1）。研究人员在DRE病人的嗅觉、额叶和颞叶的11例样本中均观察到浸润性免疫细胞在大脑中的分布（图1c）。因此，研究人员清晰地鉴别了大脑中小胶质细胞、免疫细胞和非免疫细胞，并且量化了细胞表面特异性蛋白及基因表达水平。

图1 癫痫脑组织中小胶质细胞和浸润的免疫细胞分布情况

（图源：Kumar, et al., Nat Neurosci, 2022）

众所周知，小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，在神经发生、突触形成和修剪以及维持神经元稳态中发挥作用[8]。近年来，基于单细胞基因组的研究深入揭示了小胶质细胞亚型的多样性，反映了它们的不同功能表型。在这里，研究人员利用单细胞转录组学探究了DRE组织小胶质细胞中是否存在炎症通路的激活。结果发现，AIF1和CSF1R基因广泛表达于小胶质细胞亚群，而CX3CR1、P2RY12和TREM2等小胶质细胞标记基因分布在不同的亚群。有意思的是，尽管癫痫被认为不是神经炎症介导的疾病类型，然而研究人员分析转录组学数据发现，促炎信号的细胞因子如IL1b、TL18、IL18、CXCL8（IL-8）和CCL4广泛表达于小胶质细胞集群，提示DRE中的确存在明显的促炎通路的激活。进一步地，尽管癫痫不被认为是初级免疫介导的疾病，但作者发现，DRE小胶质细胞集群7、5、9和11中高表达TNF、HLA-DRA和HLA-DPB1等基因，而低表达CX3CR1和P2RY12等基因，补体通路相关基因也高表达在这些DRE小胶质细胞中。在不考虑个体差异和甚至是空间位置差异的情况下，这些结果在所有的DRE小胶质细胞集群中都是一致的。为了进一步验证转录组学的发现，研究人员利用多光谱多色免疫组织化学技术对大脑微环境进行成像分析，发现DRE脑组织小胶质细胞分泌大量的促炎细胞因子IL-1b（图2）。除此之外，星形胶质细胞也能产生部分IL-1b。上述多模态单细胞技术CITE-seq结合多重免疫荧光染色结果详细描述了DRE脑组织的免疫微环境显著异常和外周免疫细胞（包括CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺T细胞、以及成熟的具有细胞毒性的自然杀伤细胞等）大量浸润到脑实质，发挥神经促炎和细胞毒性功能，从而成为DRE的潜在致病机制。

图2 癫痫脑组织中促炎信号激活和小胶质细胞特有基因高表达

（图源：Kumar, et al., Nature Neurosci, 2022）

为了研究外周免疫细胞是否分别和神经血管细胞单元及小胶质细胞之间存在直接的功能互作。基于细胞水平的受体和配体之间功能网络互作分析，研究人员发现大量趋化因子和炎症因子表达在免疫细胞亚群，而同源的受体在神经血管细胞单元显著富集。如TNF、CCL5和TGFB1表达在免疫细胞亚群，而同源受体TNFRSF21、ACKR1和ACRL1则在神经血管细胞单元表达。为了进一步拓展互作分析的结果，研究人员分离颞叶性癫痫模型小鼠海马组织进行转录组测序，互作分析结果进一步证实外周免疫细胞浸润到脑实质发挥促炎功能（图3）。

图3 癫痫模型小鼠存在显著的配体受体互作

（图源：Kumar, et al., Nat Neurosci, 2022）

DRE的微环境是一种趋化性环境，并且脑实质浸润大量促炎和细胞毒性免疫细胞，同时小胶质细胞分泌大量促炎细胞因子。基于这些发现，提示浸润的免疫细胞和小胶质细胞之间可能存在直接的功能互作。为此，研究人员对集群3（小胶质细胞亚群）进行免疫组化荧光染色分析，发现集群3是一种混合的双峰集群，表达CD3、CD11b和HLA-DR等表面蛋白，暗示集群3包含T细胞、小胶质细胞以及巨噬细胞；集群3的确表达C3、CSF1R、APOE和CX3CR1等小胶质细胞特有的基因。为了进一步探究集群3中免疫细胞谱系和小胶质细胞直接的功能互作，研究人员将集群3再次分群得到了6个亚群（图4）。其中，发现CD8⁺ T细胞集群和CD4⁺ T细胞集群占据高达73%。进一步利用物理相互作用细胞测序分析后发现，CD4⁺ T细胞与小胶质细胞细胞之间有143个关联调节基因（图4d,e），CD8⁺ T细胞与小胶质细胞细胞之间有164个关联调节基因（图4f,g），提示了免疫细胞与小胶质细胞之间的潜在功能（即促炎与细胞毒性）互作。进一步地，研究人员通过免疫组织化学和流式细胞术实验，证实了T细胞和小胶质细胞之间直接形成物理接触形成复合体结构促进了细胞因子IL-1b的产生，促进炎症信号激活（图4h-k），对比之下，小胶质细胞和T细胞没有物理接触的炎症信号激活不明显。

图4 癫痫脑组织中小胶质细胞和T细胞之间发生直接的功能互作

（图源：Kumar, et al., Nat Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究利用单细胞转录组学结合抗原表位检测（CITE-seq）揭示了耐药性癫痫病人病灶组织的免疫转录组学变化，癫痫脑实质内存在促炎的免疫微环境，包括小神经胶质细胞的广泛激活，以及T细胞和自然杀伤细胞其他外周促炎免疫细胞的浸润。基于受体配体相互作用分析进一步揭示了浸润脑实质的T细胞和小胶质细胞之间形成物理接触，促进炎症信号的表达。该研究主要集中在大脑常驻免疫和浸润免疫，主要集中在转录水平上分析了单个细胞功能。由于基因变化并不能直接反应蛋白功能，后续功能研究和靶向治疗需要在蛋白质水平进一步验证。除此之外，由于星形胶质细胞也参与神经炎症，在癫痫病理进程中发挥重要作用。聚焦于星形胶质细胞如何参与外周免疫细胞浸润以及星形胶质细胞和外周免疫细胞功能互作需要有待进一步研究。总之，该研究首次阐明了在癫痫中免疫细胞浸润的潜在机制，并为小神经胶质细胞和T细胞的直接相互作用提供了证据。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41593-022-01095-5

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Reynolds, E. H. Te ILAE/IBE/WHO global campaign against epilepsy: bringing epilepsy “out of the shadows”. Epilepsy Behav. 1, S3-S8 (2000).

[2] Epilepsy: Key Facts. WHO https://www.who.int/ (2018).

[3] Lerche, H. Drug-resistant epilepsy-time to target mechanisms. Nat. Rev. Neurol. 16, 595-596 (2020).

[4] Ravizza, T. et al. Innate and adaptive immunity during epileptogenesis and spontaneous seizures: evidence from experimental models and human temporal lobe epilepsy. Neurobiol. Dis. 29, 142-160 (2008).

[5] Vezzani, A., Balosso, S. & Ravizza, T. Neuroinfammatory pathways as treatment targets and biomarkers in epilepsy. Nat. Rev. Neurol. 15, 459-472 (2019).

[6] Xu, D. et al. Peripherally derived T regulatory and γδ T cells have opposing roles in the pathogenesis of intractable pediatric epilepsy. J. Exp. Med. 215, 1169-1186 (2018).

[7] You, S. J., Jung, D. E., Kim, H. D., Lee, H. S. & Kang, H. C. Efcacy and prognosis of a short course of prednisolone therapy for pediatric epilepsy. Eur. J. Paediatr. Neurol. 12, 314-320 (2008).

[8] Stratoulias, V., Venero, J. L., Tremblay, M. E. & Joseph, B. Microglial subtypes: diversity within the microglial community. EMBO J. 38, e101997 (2019).

本文完