J Neuroinflammation｜雷平课题组发现间充质干细胞通过抑制铁死亡改善反复轻度创伤性脑损伤引起的认知障碍

撰文︱王栋，雷平

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

反复轻度创伤性脑损伤（repetitive mild traumatic brain injury，rmTBI）是神经退行性疾病的主要危险因素之一，其发生率不断增加。然而rmTBI的潜在机制仍不清楚。铁死亡（ferroptosis）是最近发现的一种由铁催化下的脂质损伤引起的程序性细胞死亡形式，存在于多种中枢神经系统疾病中，如帕金森病、阿尔茨海默病，创伤后癫痫和脑出血等[1]，但其在rmTBI中的确切作用尚不清楚。间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）是干细胞治疗中研究最多的实验细胞，MSCs通过产生外泌体和生长因子，抑制神经炎症在中枢神经系统疾病中发挥多种保护作用[2]，但关于MSCs在铁死亡和rmTBI后神经变性中的作用尚不清楚。

2022年7月15日，天津医科大学总医院雷平课题组在Journal of Neuroinflammation上发表了题为“Mesenchymal stromal cell treatment attenuates repetitive mild traumatic brain injury-induced persistent cognitive deficits via suppressing ferroptosis”的研究论文，提出间充质干细胞治疗可能通过抑制铁死亡改善rmTBI引起的持续性认知障碍。王栋，张释双和葛歆瞳为论文共同第一作者，雷平教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现，rmTBI导致了铁死亡相关生物标志物水平的时间依赖性改变，如铁代谢异常、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）失活和表达降低、脂质过氧化升高。此外，MSC治疗显著降低了上述rmTBI诱导的改变以及神经元损伤和病理性蛋白沉积，并改善了认知功能。该研究为rmTBI后细胞死亡提供了新见解，并为未来rmTBI细胞死亡靶向治疗的研究奠定了基础。

铁积累是铁死亡的特征之一。铁在不同的基础代谢过程中发挥重要作用。多种蛋白质维持细胞内铁的稳态，转铁蛋白受体1（Tfr1）调节铁的转入，而运铁蛋白（Fpn）调节铁的输出[3]。异常的铁稳态与铁死亡有关，可诱发中枢神经系统病理。为了确定rmTBI后是否出现铁稳态失衡，作者对rmTBI后不同时间点（1、3、7、14、28、42天）组和假手术组进行了免疫印迹测试和Fe²⁺含量测定。作者发现，与假手术组相比，rmTBI后28天Tfr1水平显著升高，而rmTBI后1天至42天Fpn水平显著下降（图1A, B）。同时，作者发现从rmTBI后第7天开始，小鼠的Fe²⁺水平显著高于假手术组小鼠，并在rmTBI后第28天达到峰值(图1C)。这表明Tfr1和Fpn水平异常导致rmTBI后铁转运失衡，促进了铁的蓄积，提示rmTBI后发生铁代谢紊乱。

GPx4在铁死亡的调控中发挥重要作用，它对膜脂中的氢过氧化物具有直接解毒作用，同时能够抑制脂质过氧化产物，如4-羟基壬烯醛（4-HNE）的产生[4]。GPx4功能异常被认为是铁死亡的原因之一[5]。利用GPx活性测定，作者发现，与假手术组相比，从rmTBI后第3天开始GPx活性显著下降。在rmTBI后的第28天检测到最低的GPx活性(图1D)。利用免疫荧光染色，作者发现，自rmTBI后第1天至第42天，小鼠脑海马区GPx4阳性细胞数量显著降低，自rmTBI后第3天至第42天，皮质区GPx4阳性细胞数量显著降低(图1E)。同样，免疫印迹检测结果显示，rmTBI后第3天至第42天GPx4蛋白水平显著降低(图1F, G)。这些结果表明，rmTBI后GPx4的活性和数量均显著降低。

脂质过氧化产物4-HNE和线粒体形态学变化是铁死亡的重要标志。利用免疫印迹测试和透射电镜，作者发现，与假手术组相比，rmTBI后28天和42天，4-HNE蛋白水平显著升高(图1F, G)。同时，rmTBI后第28天小鼠脑内出现明显的线粒体收缩和线粒体嵴减少或消失(图1H, I)。综上，作者检测到rmTBI后铁死亡的特征性变化，如铁代谢异常、GPx失活、GPx4表达降低、脂质过氧化产物增加和线粒体收缩。这些结果均提示rmTBI后会发生铁死亡。

图1rmTBI后检测到铁死亡的发生

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了确定rmTBI后是否发生神经元丢失和神经退行性变，利用免疫印迹测试和FJC(退行性神经元标志物)染色，作者发现rmTBI后第7天到第42天，NeuN蛋白水平显著低于假手术组(图2A, B)。另外，与假手术组相比，rmTBI后第3天至第42天，小鼠脑皮质和海马区FJC阳性细胞数量均显著增加(图2C, D)。这一结果表明rmTBI后神经元丢失和神经变性增加。此外，通过线性相关分析，作者发现GPx活性与神经元退化呈明显的负相关(图2E)。这提示铁死亡可能与神经变性相关。

图2rmTBI后神经元丢失和神经变性增加

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

MSCs在中枢神经系统疾病中发挥重要的神经保护作用，然而MSCs对rmTBI后认知功能的影响尚不清楚。作者使用CD90免疫荧光染色，鉴定MSCs(图3A)。借助MAB1281免疫荧光染色，观察MSCs是否可以到达小鼠大脑。作者在MSC处理的小鼠大脑中发现MAB1281+细胞(图3B)。这一结果表明rmTBI后MSCs可穿透血脑屏障。

利用转棒试验评估小鼠的运动协调能力，作者发现四组小鼠的转棒表现没有显著性差异(图3C)，这提示rmTBI小鼠的运动协调能力没有受损。作者进一步通过新物体识别试验和水迷宫试验评价MSCs对rmTBI小鼠学习和记忆能力的影响。在新物体识别试验中，作者发现，与正常组相比，rmTBI组的NORI值明显降低，而与rmTBI组相比，MSCs和Lip-1组NORI值显著升高(图3D)。这表明MSC治疗可以明显改善rmTBI小鼠的认知功能。在水迷宫试验中，作者发现，正常小鼠表现出与训练相关的逃避潜伏期减少，而rmTBI小鼠的逃避潜伏期明显延长，且穿越平台次数显著减少，第一次到达平台的潜伏期显著增加；而与rmTBI组相比，MSC或lip-1组小鼠的逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数显著增加，第一次到达平台的时间显著减少(图3F, G, H)。此外，作者比较了四组小鼠的平均游泳速度，没有发现显著差异(图3I)。以上结果表明MSC可以明显改善rmTBI小鼠的空间学习和记忆功能。

图3 MSC治疗减轻rmTBI诱导的小鼠持续性认知功能障碍

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

rmTBI是神经退行性变发生发展的重要危险因素，神经退行性变的主要特征是Aβ、tau蛋白沉积增加和认知功能障碍[6]。在本研究中，作者观察到，与正常组相比，rmTBI组的病理蛋白(APP、Aβ1-42、p-Tau / Tau-5)水平显著升高，而与rmTBI组相比，MSCs组和Lip-1组的病理蛋白水平显著降低(图4A, B, C, D)。表明MSC治疗可以减少rmTBI后的病理蛋白沉积。

此外，作者利用小动物PET/CT观察小鼠脑成像的改变。采用[¹⁸F] S16-tau探针检测脑Tau表达，结果发现，与正常组相比，rmTBI组小鼠脑皮质和海马S16-tau的标准化摄取值(SUV)显著升高。然而，与rmTBI组相比，MSCs和Lip-1组的SUV明显降低(图4E, F)，表明MSC治疗可显著降低rmTBI引起的Tau蛋白聚集。此外，从[¹⁸F] FDG-SUV结果来看，与正常组相比，rmTBI组小鼠脑皮质和海马内SUV明显降低;与rmTBI组相比，MSCs和Lip-1组的SUV明显升高(图4E, G)，表明MSC治疗改善了rmTBI诱导的糖代谢下降。

图4 MSC治疗减少了rmTBI后的病理性蛋白质沉积，促进了糖代谢

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了更好地研究MSCs对rmTBI诱导的神经元损伤的影响，采用FJC染色和免疫印迹检测神经变性和神经元存活情况。作者发现，MSC或Lip-1处理后rmTBI小鼠脑内FJC阳性细胞数量明显减少(图5A, B)，NeuN蛋白表达量显著升高(图5C, D)，表明rmTBI后，MSC治疗可促进神经元存活，减少神经退行性变。

图5MSC治疗挽救了rmTBI诱导的神经退行性变和神经元丢失

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

为了确定MSCs在rmTBI介导的铁死亡中的作用，利用铁含量测定、GPx活性测定和免疫印迹检测，作者发现，MSC或Lip-1处理显著抑制了rmTBI诱导的Tfr1上调和Fpn下调(图6A, B)，以及Fe²⁺含量升高，并明显缓解了GPx活性的下降(图6C, D)，同时，MSC或Lip-1处理显著增加了GPx4蛋白的表达，减少了4-HNE蛋白的表达(图6E, F)。以上结果表明，MSC可调节与铁代谢相关的蛋白水平，减少铁超载，恢复GPx活性和GPx4数量，抑制脂质过氧化，从而挽救rmTBI诱导的铁死亡。这提示抑制铁死亡可能是MSCs减轻rmTBI后神经退行性变和持续性认知障碍的重要机制。

图6MSC治疗抑制rmTBI诱导的铁死亡

（图源：Wang D et al., J Neuroinflammation, 2022）

图7MSC治疗抑制rmTBI诱导的铁死亡示意图

（图源：Wang D et al.,J Neuroinflammation, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

本研究证实反复轻度创伤性脑损伤（rmTBI）后发生了铁死亡，其特征为铁积累、GPx4异常、脂质过氧化增加和线粒体萎缩（图7）。然而，需要更多的研究来探索铁死亡参与rmTBI后认知受损的确切途径。MSCs是一种多能干细胞，已被广泛研究，是再生治疗的首选干细胞。本研究发现MSCs可能通过抑制铁死亡，减少rmTBI的神经元变性和丢失、减少病理性蛋白沉积，从而减轻持续性认知障碍（图7）。然而，除了铁死亡之外,其他程序性细胞死亡途径，包括凋亡、焦亡、坏死、自噬等也会在脑损伤后被激活，参与疾病的进程。具体哪些细胞死亡方式在rmTBI的病理进展中占主导地位，仍有待进一步研究，这也将为MSC的临床转化奠定基础。

总之，本研究为今后针对rmTBI细胞死亡治疗的研究奠定了基础，并为改善rmTBI认知转归提供了新的治疗策略。

原文链接：https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-022-02550-7

通讯作者雷平

（照片提供自天津医科大学总医院雷平课题）

通讯作者课题组简介（上下滑动阅读） 

雷平教授，博士生导师。天津医科大学校长，天津医科大学总医院党委书记，天津市老年医学研究所所长，中枢神经损伤修复与再生教育部重点实验室主任。国家“百千万人才”，人社部“有突出贡献中青年专家”，国务院政府特殊津贴专家，天津市教委“十三五”学科领军人才，天津市“131”创新型人才团队第一层次人才。任中国医师协会老年医学科医师分会副会长、中华医学会老年医学分会全国委员、天津市医师协会老年医学科医师分会会长、天津市医学会老年医学分会副主任委员，长期聚焦慢性颅脑创伤致认知障碍的作用机制及潜在干预策略，先后主持国家自然科学基金等国家级、省部级项目十余项。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Geng Z, Guo Z, Guo R, Ye R, Zhu W, Yan B: Ferroptosis and traumatic brain injury. Brain Res Bull 2021, 172:212-219

[2] Scopetti M, Santurro A, Gatto V, La Russa R, Manetti F, D'Errico S, Frati P, Fineschi V: Mesenchymal stem cells in neurodegenerative diseases: Opinion review on ethical dilemmas. World J Stem Cells 2020, 12:168-177

[3] Liang H, Tang T, Huang H, Li T, Gao C, Han Y, Yuan B, Gao S, Wang H, Zhou ML: Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ameliorates neuronal ferroptosis after traumatic brain injury in mice by inhibiting cyclooxygenase-2. Exp Neurol 2022, 354:114100.

[4]  Wang Y, Chen J, Lu J, Xi J, Xu Z, Fan L, Dai H, Gao L: Metal ions/nucleotide coordinated nanoparticles comprehensively suppress tumor by synergizing ferroptosis with energy metabolism interference. J Nanobiotechnology 2022, 20:199.

[5]  Li Q, Han X, Lan X, Gao Y, Wan J, Durham F, Cheng T, Yang J, Wang Z, Jiang C, et al: Inhibition of neuronal ferroptosis protects hemorrhagic brain. JCI Insight2017, 2:e90777

[6] Iraji A, Khoshneviszadeh M, Firuzi O, Khoshneviszadeh M, Edraki N: Novel small molecule therapeutic agents for Alzheimer disease: Focusing on BACE1 and multi-target directed ligands. Bioorg Chem 2020, 97:103649

本文完