Science︱利用单细胞多组学技术分析墨西哥蝾螈的神经发生和再生

撰文︱杨  思

责编︱王思珍，方以一

编辑︱夏  叶

墨西哥蝾螈（Ambystoma mexicanum）是一种两栖动物，代表了与羊膜动物（即四足脊椎动物）最接近的活体亲属之一，因此适合对大脑脑细胞类型、神经元连接和功能进行比较研究。蝾螈在切除背侧区域后，还能通过激活神经发生来再生端脑[1]，这在胚胎期后的生命中也存在[2]。所有具有神经系统的后生动物中都可以发现神经发生。然而，在脑损伤后神经发生几乎不存在。另外，在蝾螈和哺乳动物中观察到的神经发生之间的分子关系还没有被探索。此外，蝾螈大脑中稳态期间和再生性神经发生期间的相似性和差异性也不清楚。

近日，来自苏黎世联邦理工学院生物系统科学和工程系的Barbara Treutlein教授联合维也纳生物中心分子病理学研究所的Elly M. Tanaka教授课题组共同在Science上发表了题为“Single-cell analyses of axolotl telencephalon organization, neurogenesis, and regeneration”的研究论文，深入探究了以蝾螈为研究对象的四足动物的神经系统的组织、进化和再生。作者使用单细胞基因组方法对蝾螈端脑在稳态和再生过程中的细胞群进行了鉴定；确定了与海马、背部和侧部皮质的羊膜动物神经元相似的谷氨酸能神经元，以及保守的GABA能神经元类群；推断了胚胎后特定脑区神经发生的转录动态和基因调控关系，并解读了保守的分化特征；以及脑损伤后，室管膜胶质细胞（ependymoglia cell）在重建失去的神经元群体和轴突连接之前激活了损伤的特异性状态。

首先，该研究团队绘制了蝾螈端脑（telencephalon）的单细胞核转录组测序（snRNA-seq）图谱（图1）。作者将端脑解剖为内侧、背侧和外侧三个区域，并运用单细胞多组学技术（snRNA-seq、snATAC-seq）分析；鉴定了共48136个细胞核，聚类成95个神经元和非神经元类群；应用免疫荧光染色和RNA原位杂交链（HCR）反应来定位细胞类型在脑区的位置。结果发现，室管膜胶质细胞主要分布于每个脑室区，而神经母细胞（neuroblast）分布相对稀疏; GABA能神经元沿脑室内侧、背侧和外侧区稀疏分布，在纹状体内则密集分布；谷氨酸能神经元主要定位于脑室内侧、背侧、外侧和额叶; 少突胶质细胞和小胶质细胞分散于所有脑室区域。作者也分析了每个细胞类群在皮质区域中的丰度。总之，这些数据提供了蝾螈端脑细胞群的全局图谱，并提示了神经源性的区域特异性。

图1 蝾螈端脑的细胞多样性

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

接下来，作者研究了蝾螈谷氨酸能神经元的区域保守性（图2）。羊膜动物端脑的谷氨酸能神经元表现出高度的转录组多样性。作者通过从以下三个方面来分析谷氨酸能神经元物种之间的差异性和相似性：（1）蝾螈和羊膜动物之间共享的差异表达基因和差异表达转录因子；（2）整合蝾螈、乌龟和小鼠端脑的单细胞和单核数据集来计算细胞类群之间的相关性；（3）应用空间转录组技术定位谷氨酸能神经元亚群的位置。结果发现，蝾螈大脑皮层内侧的神经元（谷氨酸能神经元）与其他羊膜动物海马神经元（谷氨酸能神经元）具有明显的转录组学相似性，但并未观察到这些神经元类群在脑区海马CA1、CA3和齿状回的明显区别。进一步地结果分析提示，与羊膜动物嗅皮层神经元具有转录组学相似性的神经元和在嗅觉处理中发挥作用的神经投射之间存在很强的对应关系。

图2 蝾螈端脑谷氨酸能神经元

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

再接着，作者应用类似的分析思路，研究了蝾螈GABA能神经元在羊膜动物之间的保守性特征（图3）。在GABA能神经元中，作者共鉴别到30个细胞亚群。并通过转录因子的保守性分析，推测出这些亚群主要起源于外侧、尾部和内侧神经节隆起（分别简称为LGE、CGE、MGE）。再通过与乌龟和小鼠的单细胞转录组数据整合，并计算亚群之间的相似性。结果发现，在13个起源于LGE的蝾螈GABA能神经元亚群中，有11亚群与乌龟或小鼠纹状体和嗅球GABA能细胞相关。进一步分析表明：在蝾螈、龟和小鼠三种羊膜动物之间，纹状体和嗅球的LGE来源GABA能神经元具有很强的转录相似性；CGE、MGE来源GABA能细胞群分布于所有区域，LGE来源GABA能细胞群则主要位于纹状体中。总之，这些数据强烈暗示了蝾螈端脑的GABA能神经细胞的来源（即细胞迁移和定位）。

图3 蝾螈端脑GABA能神经元

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

蝾螈端脑室管膜胶质细胞和神经母细胞的转录组学分析（图4）。蝾螈端脑室管膜细胞被聚类为三种细胞类型：静息型（quiescent）、活跃型（active）和前神经型（pro-neuro），它们有明显的脑区亚细胞特征；在胚胎后的蝾螈大脑中，除了前神经型室管膜胶质细胞外，静息型和活跃型室管膜胶质细胞会继续表达皮层特征基因（pallial patterning genes）。对于神母经细胞，基于细胞特征基因表达，神经母细胞被鉴别为两类：Slc17a6/7（VGLUT）类和Gad1/2（GABA）类；VGLUT类富集于内侧和背侧脑区，GABA类则主要富集于外侧脑区。作者还研究了蝾螈的室管膜胶质细胞和神经母细胞与成年小鼠脑室下区神经元干细胞和神经元前体细胞的相关性。结果发现，蝾螈端脑含有表达下游神经元的神经递质特征的成神经细胞；蝾螈神经母细胞与小鼠神经元前体细胞和神经母细胞最相似，而蝾螈室管膜胶质细胞与小鼠室管膜细胞以及神经干细胞具有转录相似性。

图4 蝾螈端脑的室管膜胶质细胞核成神经细胞

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

蝾螈胚胎后谷氨酸能神经发生的转录组学动态分析（图5）。作者使用Cre-loxP介导的示踪技术来标记室管膜胶质细胞，以研究它们的自我更新特性并确定它们在胚胎后神经发生期间的更新模式，以及谷氨酸能神经元从激活态室管膜胶质细胞到分化阶段的谷氨酸能神经元的神经发生过程。利用RNA速率分析和基于URD[3]的轨迹分析来探究神经发生的细胞和分子动态变化。作者观察到，尽管所有的神经发生轨迹植根于活性的室管膜胶质细胞，但并非所有的轨迹都含有成神经细胞中间体；作者还发现了许多沿伪时间轨迹特异性表达变化的基因；但也发现了一些沿伪时间轨迹一致表达的基因。这些数据强调了蝾螈端脑中形成神经元多样化的调节关系。

图5 胚后神经发生的基因调控程序

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

蝾螈端脑再生过程中的细胞和分子动态变化研究（图6）。为此，通过不同时间点损伤端脑的背侧区域（切除一个1×1×1毫米的区域），并应用snRNA-seq与EdU标记S期细胞相结合的研究策略，即Div-seq分析[5]。首先，在损伤后第1周，损伤部位为开放状态，EdU⁺室管膜胶质细胞分布于损伤位点内侧和外侧相邻区域。在损伤后第2周，受损部位因EdU⁺细胞的积累而开始关闭。在以后的整个损伤时间点，EdU⁺细胞在再生部位（即损伤部位）继续积累，直到组织结构基本重建。接着，作者分析了EdU⁺细胞在再生过程中的转录组变化。通过数据整合和聚类分析，确定了主要的细胞类型，包括室管膜胶质细胞、神经母细胞、谷氨酸能和GABA能神经元等。在整个再生过程中，每种细胞类型的比例不同，提示损伤引起神经新生。具体表现为，损伤后第1周，EdU⁺细胞主要由活跃的室管膜胶质细胞构成，损伤后第2周和第4周，神经母细胞数量最多。从损伤后第6周开始，大部分EdU⁺细胞为谷氨酸能和GABA能神经元。最后，作者将神经生物素注射到已再生神经元域（Satb1⁺、Rorb⁺），以确定传入性和传出性神经投射是否也被重建。结果发现，在损伤后第8周，与非损伤的大脑相似，损伤大脑被神经生物素标记阳性的细胞体分布于嗅球、附属嗅球和杏仁核，表明这些区域的神经信号输入在损伤后第8周的再生的端脑中被重新建立。

图6 蝾螈端脑损伤后的再生

（图源：Lust, Katharina, et al., Science, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究团队使用单核转录组测序（snRNA-seq）、多组学测序和Div-Seq、空间转录组学、Cre-loxP示踪、RNA原位杂交链（HCR）反应和抗体染色，构建了稳态和再生过程中蝾螈端脑的全面单细胞图谱。与乌龟和小鼠数据集的比较分析揭示了蝾螈端脑细胞类型的转录相似性及其在四足动物细胞之间的保守性。分析了室管膜胶质细胞和成神经细胞的多样性。使用轨迹推理来构建稳态下神经发生的分化轨迹，发现室管膜胶质细胞基本上通过不同的中间神经母细胞类型进行，并使用特定的基因调控网络来形成不同的谷氨酸能神经元类型。最后，相比较于哺乳动物神经胶质细胞，蝾螈的室管膜胶质细胞在损伤后显示出神经源性活性和损伤特异性的转录状态。此外，Satb1/Rorb谷氨酸能神经元在损伤后重新生成，并重新建立来自嗅球的信号输入连接；这些神经元的转录谱、连接性和潜在功能的保守性使得蝾螈适合于研究功能性神经回路的恢复。蝾螈大脑如何再生的研究，可能为其他生物体的大脑再生研究提供参考。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp9262

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Amamoto, Ryoji, et al. "Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury." Elife 5 (2016): e13998.

[2] Maden, Malcolm, Laurie A. Manwell, and Brandi K. Ormerod. "Proliferation zones in the axolotl brain and regeneration of the telencephalon." Neural development 8.1 (2013): 1-15.

[3] Bergen, Volker, et al. "Generalizing RNA velocity to transient cell states through dynamical modeling." Nature biotechnology 38.12 (2020): 1408-1414.

[4] Fleck, Jonas S., et al. "Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids." bioRxiv (2021).

[5] Habib, Naomi, et al. "Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons." Science 353.6302 (2016): 925-928.

本文完