增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离的并发症，其特点是形成视网膜表面或视网膜下的增殖膜，并可导致视力丧失或严重失明[1]。PVR发生于约5-10%的视网膜脱离病例中，手术治疗是目前主要的治疗方法，但手术后很容易复发[2]。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是PVR增殖膜内的主要细胞成分，其上皮-间质转化（Epithelial–mesenchymal transition，EMT）被认为是PVR的主要致病机理之一[3,4]。在PVR的发展过程中，RPE细胞EMT可以促使它们由上皮细胞向纤维化细胞重编程，导致收缩性视网膜脱离或视网膜下增殖膜的形成[1,5,6]。然而，这种进展的调控机制尚未完全清楚。因此，探索驱动PVR这一过程的分子机制为临床治疗PVR提供药物靶点具有极其重要的意义。2023年2月25日，温医大眼视光学与视觉科学国家重点实验室发育细胞生物学与疾病研究团队在Cell Death and Disease杂志上发表了题为“DAPL1 prevents epithelial –mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium and experimental proliferative vitreoretinopathy”的研究。该研究利用Dapl1基因敲除小鼠（Dapl1-/-）、野生型（WT）和腺相关病毒 AAV9-DAPL1 介导的基因治疗手段，结合青紫蓝兔PVR 模型，明确了DAPL1调控RPE细胞EMT抑制PVR的作用及其分子机制。为了探究 DAPL1在RPE细胞EMT和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中的功能作用，研究者首先分析了DAPL1在PVR患者增殖膜中的表达，并与正常眼球捐献者RPE细胞中的表达进行比较，发现DAPL1 mRNA在PVR增殖膜中的表达下降（图1 A），这表明DAPL1可能参与RPE-EMT状态和 PVR进展的调控。为了进一步回答这个问题，研究者利用Dapl1基因敲除小鼠（Dapl1-/-）、野生型（WT）和腺相关病毒AAV9-DAPL1介导的基因治疗等手段，通过Western blot、定量PCR、视网膜石蜡切片H&E染色、EMT marker 免疫荧光染色等研究手段分析在生理状态和视网膜脱离状态下8周龄小鼠RPE 细胞发生EMT的情况。此外，在青紫蓝兔玻璃体腔中注射ARPE-19细胞建立实验性PVR模型，比较ARPE-19+DAPL1注射眼与ARPE-19+EGFP注射眼发生PVR的严重程度，以及检测AAV-CMV-DAPL1基因治疗实验性PVR的效果。结果表明，Dapl1-/-小鼠RPE细胞上皮标志物ZO-1和E-cadherin的蛋白水平下降，间充质标志物ZEB1、N-cadherin、Vimentin和SNAIL的蛋白水平明显增加，与8周龄WT小鼠相比，同龄Dapl1-/-小鼠RPE细胞之间的紧密连接消失，细胞形态也部分转变为间质表型失去了规则的六边形结构（图1 B-E）。视网膜脱离是PVR的致病因素之一，为此研究者在小鼠视网膜脱离状态下做H&E及免疫荧光染色，发现Dapl1-/-小鼠的RPE异常迁移至视网膜下腔，发生间质转化并伴有异常增殖（图1F-G），EMT标记物α-SMA在Dapl1-/-小鼠RPE细胞中表达显著增加（图1H）。以上实验结果表明在生理情况和视网膜脱离的情况下，DAPL1缺陷都会促进RPE细胞发生EMT。（图源：Ma et al., Cell Death Dis. 2023）为了进一步明确DAPL1调控RPE细胞EMT的功能作用，研究者通过AAV（腺相关病毒）介导的基因转移，使用RPE细胞特异性的RPE65（视黄素异构酶 retinoid isomerohydrolase , RPE65）启动子在RPE细胞中特异性高表达DAPL1。在Dapl1-/-小鼠中，AAV9-DAPL1注射眼RPE细胞中HA 标记的DAPL1水平增加并促进上皮标记ZO-1、E-cadherin的表达，降低间充质分子marker ZEB1、N-cadherin、Vimentin和SNAIL的蛋白水平。此外，在Dapl1-/-小鼠RPE细胞中过表达DAPL1，可以恢复 RPE细胞之间的紧密连接和六边形结构（图 2C）。在小鼠视网膜脱离情况下，AAV9-NC注射眼中可以观察到RPE细胞发生间充质转化，但在AAV9-DAPL1注射右眼中，视网膜下增殖膜面积明显下降（图 2D-E）。OTX2免疫荧光进一步证实AAV9-NC注射眼RPE细胞呈多层结构，而AAV-DAPL1注射眼 RPE细胞则为单层结构（图 2F）。此外，冰冻切片免疫荧光染色显示，在AAV-DAPL1注射眼中，α-SMA的表达显著下降（图 2G）。这些数据均表明高表达DAPL1 能够在体逆转Dapl1-/-小鼠RPE细胞EMT。图2. 高表达DAPL1抑制Dapl1-/-小鼠RPE细胞EMT（图源：Ma et al., Cell Death Dis. 2023）为了在体探究DAPL1对PVR的影响，研究者构建了实验性兔PVR模型，并在注射后第30天和第38天评估 PVR 的严重程度。根据眼底照片和光学相干断层扫描（OCT）分析，注射 ARPE-19+EGFP细胞眼显示出严重的视网膜脱离，而注射ARPE-19+DAPL1细胞眼则保有相对完好的视网膜结构（图3A-B）。H&E 染色结果显示， ARPE-19+EGFP细胞注射眼中观测到视网膜褶皱、视网膜脱离以及视网膜前层及视网膜下增殖膜的形成，但在 ARPE-19+DAPL1 细胞注射眼中未观测到明显增殖膜形成（图3C）。此外，切片免疫荧光显示，DAPL1在ARPE-19细胞中过表达抑制了视网膜前层和视网膜下增殖膜的形成，并抑制了细胞 EMT分子marker α-SMA的表达（图3D）。最后，根据Fastenberg评分法评估 PVR的严重程度，与ARPE-19+EGFP细胞相比，过表达DAPL1的ARPE-19细胞诱导PVR的能力降低（图3E）。这些结果均表明，DAPL1能有效抑制实验性PVR的进展。（图源：Ma et al., Cell Death Dis. 2023）机制部分研究表明DAPL1通过上调RPE细胞中NFκB（RelA）的表达来促进P21的磷酸化及其稳定性，而在DAPL1过表达的ARPE-19细胞中，P21的敲减导致ZO-1蛋白水平减少，EMT标志物Vimentin和SNAIL蛋白水平增加（图4A-B），表明敲减P21减弱了DAPL1抑制 EMT 的功能。研究者将ARPE-19+DAPL1+shNC或ARPE-19+DAPL1+shP21细胞注射入青紫蓝兔玻璃体腔构建PVR模型，注射后第30天和38天的眼底照片（图 7C）和OCT（图 7D）显示，ARPE-19+DAPL1+shP21细胞注射眼显示出严重的视网膜脱离，而ARPE-19+DAPL1+shNC细胞注射眼则显示相对完整的视网膜结构（图4C-D）。H&E染色也证实了视网膜脱离的结果（图4E）。此外，ARPE-19+DAPL1细胞中敲减P21促进了视网膜表面和视网膜下增殖膜的形成，并导致EMT分子marker α-SMA在膜中表达增加（图4F）。相比之下，注射ARPE-19+DAPL1+shNC细胞后，α-SMA在视网膜表面和视网膜下的表达相对较弱。最后，根据Fastenberg评分法评估PVR的严重程度，ARPE-19+DAPL1细胞敲减P21后诱导PVR的能力增加（图4G）。这些结果清楚地表明敲减P21减弱了DAPL1对实验性PVR进展的抑制作用。图4. 敲减P21可抵消DAPL1对PVR的保护功能（图源：Ma et al., Cell Death Dis. 2023）
综上所述，本研究证实在RPE细胞中过表达DAPL1可以抑制RPE-EMT并减少实验性PVR进展的严重程度，其机制之一是通过NFκB上调P21稳定性发挥作用。本研究提示DAPL1有望成为治疗PVR的潜在靶点，由于RPE-EMT同样发生于年龄相关性黄斑变性等其他视网膜疾病，研究者推测 DAPL1可能在治疗RPE功能障碍相关视网膜疾病中同样具有潜在价值，期待未来有更多的工作可以揭示DAPL1的生理功能从而助力视网膜疾病的转化医学研究。本研究揭示DAPL1通过调节NFκB促进P21稳定性，NFκB可参与调节多种生物学过程，包括免疫反应、炎症反应和细胞凋亡，这表明DAPL1可能在RPE细胞和RPE功能障碍相关的视网膜病变中具有其他重要生物学功能，有待后续更广泛、深入的研究。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36841807/
温州医科大学为该论文第一研究单位，麻晓银副研究员和韩淑贤博士、刘又嘉硕士为本文共同第一作者，麻晓银副研究员和侯陵研究员为本文共同通讯作者。该研究受国家自然科学基金（82171065, 82070984, 81870664, 81770946）和温州医科大学优青培养计划等项目资助。作者介绍：麻晓银：温州医科大学副研究员，博导。眼科学博士（导师：侯陵研究员），美国NIH/NEI博士后。入选浙江省卫生高层次创新人才、浙江省高校领军人才培养计划、温州市高层次人才。主持国家自然科学基金3项、省部&市厅级项目4项。本团队招聘视网膜退行性病变研究方向博士后，有意向者欢迎联系，咨询：xyma2015@wmu.edu.cn科研学习课程精选【1】宏基因组与代谢组/脂质组学R软件数据可视化研讨会（3月25-26日 ，腾讯在线会议）【2】高分SCI文章与标书作图（暨AI软件作图）研讨会（3月25-26日 ，腾讯在线会议）【3】R语言生信数据分析及可视化作图（网络）研讨会（延期至3月31-4月2日，腾讯在线会议）【4】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（3月11-12日 腾讯在线会议）【5】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（4月8-9日 腾讯会议）
学术会议预告【1】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会【2】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction【3】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知【4】会议通知更新︱小胶质细胞生理与病理功能专题国际研讨会
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