STAR Protocols︱张青团队发表外源性标签蛋白染色质免疫共沉淀的优化实验方案

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱房文通，廖成衡

责编︱王思珍，方以一

染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验广泛用于研究DNA和DNA结合蛋白（如转录因子、辅因子或染色质相关蛋白）之间的相互作用。然而，ChIP实验的成功很大程度上取决于识别目标蛋白的抗体质量[1]。并不是所有的抗体都能用于ChIP实验，需要找到能在ChIP实验条件下特异性识别靶标蛋白的抗体。如果一级抗体特异性不高或者对目标蛋白的亲和力较低，这种情况下优化ChIP实验的其它步骤并不能改善ChIP的实验结果。因此需要开发替代的ChIP方案以研究一些目标蛋白，特别是新型DNA结合蛋白。

2022年3月17日，德州大学西南医学中心Qing Zhang （张青）团队在Cell子刊STAR Protocols杂志在线发表了题为“Optimized protocols for chromatin immunoprecipitation of exogenously expressed epitope-tagged proteins”的实验方案文章（Protocol）。该文章提出和展示了一个经过优化和验证的外源性标签蛋白的CHIP实验流程，旨在特异性抗体不可得或结合亲和力低的情况下，通过在细胞中表达外源性的标签蛋白，然后使用标签特异性抗体进行ChIP实验，实现稳定和可重复的染色质富集[2]。Qing Zhang 团队自2019年以来，已运用本研究流程进行了乳腺癌发病机制的研究，相关研究发表于eLife (2021)[3]。

在本研究方案中，作者以锌指蛋白ZHX2（Zinc Fingers and Homeoboxes 2）为例来阐述经过优化和验证的外源性标签蛋白的CHIP实验流程（图1）。作者首先通过定点突变、GATEWAY克隆和慢病毒感染等策略，构建了HA标记的ZHX2res （ZHX2 shRNA #45抵抗）表达细胞系，该细胞系能够稳定表达外源HA标记的ZHX2蛋白。然后使用ZHX2 shRNA #45敲出内源性ZHX2，从而构建出只表达外源性HA-ZHX2蛋白的细胞系。作者使用该细胞系及ChIP级HA抗体进行ChIP实验，并通过后续的ChIP-PCR验证了该ChIP方案的效果。此外，作者还优化了ChIP实验各个步骤的条件以更好的获得ZHX2蛋白的DNA富集。

图1. 外源性标签蛋白的CHIP实验方案流程图

（图源：Fang,et al., STAR Protoc, 2023）

作者首先详细的描述了抵抗敲除的ZHX2表达质粒的构建方案（图2A-2D）。以插入野生型ZHX2的pcDNA3.1(pcDNA3.1-ZHX2wt)为模板进行定点突变。ZHX2 shRNA #45的靶向位点为：CCGTAGCAAGGAAAGCAACAA，将该序列同义突变为：CCGTTGCTAGGTAAGCTACAA（下划线的序列为突变位点），产生了抵抗shRNA #45的ZHX2序列（pcDNA3.1-ZHX2res）。作者进一步以pcDNA3.1-ZHX2res为模板，应用包含attB序列的引物，进行KOD-PCR，生成attB-ZHX2res。然后通过DNA凝胶电泳和凝胶回收试剂盒，纯化attB-ZHX2res。然后，以attB-ZHX2res和供体质粒pDONR223为底物，通过BP重组反应，产生pENTR223-ZHX2res。最终，pENTR223-ZHX2res和Gateway载体质粒Gateway-HA-Vec (plenti-UBC-HA-gate-pGK-HYG)通过LR重组反应，产生表达克隆(Gateway-HA-ZHX2res)[4]。

接着，作者描述了稳定表达外源标签蛋白、敲除内源性蛋白的细胞构建。借助293T包装细胞系、pMD2.G 及psPAX2慢病毒包装质粒，应用Gateway-HA-ZHX2res 质粒构建了ZHX2过表达慢病毒，同理，应用pLKO-ZHX2 shRNA #45 (Clone ID: TRCN0000017745)构建了ZHX2敲减慢病毒。通过两轮感染、药筛，构建了稳定表达HA-标签的外源性ZHX2同时敲除内源性ZHX2的细胞系[5,6]（图2E-2F）。

图2. 稳定表达含标签的外源性蛋白的细胞系的构建

（图源：Fang, et al., STAR Protoc, 2023）

最后，作者对ChIP实验流程（细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应的逆转、DNA的纯化以及DNA的鉴定）进行了优化。其中染色质断裂为关键步骤。作者对如何获得均一的、理想长度的染色质片段进行了探索（图3）。

图3. 不同超声时间时的DNA电泳图

（图源：Fang, et al., STAR Protoc, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，在这项工作中，研究者系统地描述了表达外源性标签蛋白的细胞系构建及其CHIP实验流程。在特异性抗体不可得或结合亲和力低的情况下，通过在细胞中表达外源性的标签蛋白，然后使用标签特异性抗体进行ChIP实验，实现稳定和可重复的染色质富集。该技术可以与芯片技术和二代测序技术相结合，用来进行靶基因的高通量筛选，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102050

据悉，德州大学西南医学中心Qing Zhang（张青）教授、廖成衡博士为共同通讯作者。江苏省人民医院副主任药师房文通为第一作者。研究得到了美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，R01CA211732和R01CA256833）, 德克萨斯州癌症预防和研究所（Cancer Prevention and Research Institute of Texas，RR190058）, 美国抗癌协会（American Cancer Society， RSG-18-059-01-TBE）及美国国防部（Department of Defense，DoD W81XWH1910813）的资助。

通讯作者：Qing Zhang（张青）教授（照片提供自：张青团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

Qing Zhang（张青），德州大学西南医学中心终身副教授，任ACS 肿瘤生化与内分泌学 (TBE)和NIH Molecular Oncogenesis (MONC) study sections会员，及Science Translational Medicine科学顾问，美国病理研究学会（ASIP）和美国癌症研究协会（AACR）成员，研究方向为肿瘤生物学、遗传学、发育与疾病。曾获CPRIT Rising Star Award, ASIP Ramzi Cotran Early Career Investigator Award, DOD KCRP Idea Development Award, ACS Research Scholar Award, Kimmel Scholar Award, V Scholar Award, Susan. G. Komen Career Catalyst Award and Mary Kay Foundation Award。近年来在Science、Nat Genet、Cancer Discov、Mol. Cell、Cancer Cell、Nat Commun、PNAS等杂志发表多篇学术论文。

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【3】会议通知︱2023年成瘾与脑科学国际研讨会暨中国药物滥用防治协会成瘾与脑科学分会第一届学术会议（2023年4月9-10日，深圳）【4】会议通知︱2023中国衰老科学大会第一轮通知（2023年4月21-23日，北京）【5】会议通知︱中国神经科学学会神经影像学分会2023学术年会（2023年5月19-21日，广州）【6】学术会议预告︱Novel Insights into Glia Function & Dysfunction（2023年4月24-28日，日本）【7】会议通知︱第六届中国神经科学学会神经退行性疾病分会年会会议通知（2023年4月7-9日，湖南长沙）          参考文献（上下滑动查看）  

[1] Kidder, B.L., Hu, G., and Zhao, K. (2011). ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nature immunology 12, 918-922. 10.1038/ni.2117.

[2] Fang, W.T., Liao, C.H., and Zhang, Q. (2023). Optimized protocols for chromatin immunoprecipitation of exogenously expressed epitope-tagged proteins. STAR Protocols 4(1):102050.

[3] Fang, W., Liao, C., Shi, R., Simon, J.M., Ptacek, T.S., Zurlo, G., Ye, Y., Han, L., Fan, C., Bao, L., et al. (2021). ZHX2 promotes HIF1alpha oncogenic signaling in triple-negative breast cancer. Elife 10. 10.7554/eLife.70412.

[4] Reece-Hoyes, J.S., and Walhout, A.J.M. (2018). Gateway Recombinational Cloning. Cold Spring Harbor protocols 2018, pdb.top094912. 10.1101/pdb.top094912.

[5] Pearson, J.D., and Bremner, R. (2021). Lentiviral-mediated ectopic expression of YAP and TAZ in YAP(off) cancer cell lines. STAR protocols 2, 100870. 10.1016/j.xpro.2021.100870.

[6] Papadopoulos, D., Ade, C.P., and Eilers, M. (2022). Generation of a pooled shRNA library for functional genomics screens. STAR protocols 3, 101183. 10.1016/j.xpro.2022.101183.

编辑︱杨彬薇
本文完