经纬行研│接天莲叶无穷碧：单细胞测序技术研究（下）

经纬行研上一期“经纬行研│接天莲叶无穷碧：单细胞测序技术研究（上）”，从发展原理、相关技术和优劣势比较对单细胞测序技术进行了详细介绍，本期行研将对单细胞测序技术的市场开发情况进行介绍。

03
单细胞测序技术的应用

3.1 生殖健康方面应用

单细胞测序技术现已经被广泛地应用在干细胞研究、疾病病程监控等各个方面。生殖生物学是单细胞测序技术最早运用的领域, 其中仍有诸多问题亟待探索, 如生殖细胞的形成、早期胚胎发育和细胞命运决定。

3.1.1 精子发育

通过单细胞测序完成了精子基因图谱的绘制。早在2012年, 就有研究团队对超过100个人类精子进行了单细胞全基因组测序, 利用其中91个精子的数据构建了个体精子重组图谱, 通过比较个体精子和二倍体细胞基因组序列, 观察到单倍体精子染色体发生重组的位点, 并且在精子中发现二倍体细胞中不存在的碱基突变。

通过单细胞测序技术发现了一些与精子发育相关的基因和分子。对人类精子形成过程、功能执行和分子调控机制的进一步探索, 对早日破译男性相关生殖疾病具有重要意义。

3.1.2 卵子发育

利用单细胞测序技术, 可以捕获卵母细胞染色质信息、表观遗传修饰信息、对卵母细胞进行细胞分型等。利用单细胞测序技术对卵母细胞进行分型, 探索卵母细胞老化的机制。在对年轻和年老的非灵长类动物的卵母细胞进行单细胞转录组分析后, 发现了卵母细胞在分步发育阶段有四种亚型, 卵母细胞衰老可能与线粒体功能紊乱、内质网应激及抗氧化能力降低有关。运用单细胞测序技术提升了我们对卵细胞发育的认知, 也为辅助生殖过程中高质量卵细胞的获取和筛选提供了新的策略。

3.1.3 胚胎早期发育

利用单细胞转录组测序能够跟踪细胞的发育轨迹, 在不久的将来也可以作为我们了解哺乳动物性别决定的补充手段。研究表观遗传调控和母体环境与生殖成功之间的相互作用, 有助于了解胚胎发育过程中的调控网络和保护机制, 对妊娠相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。利用早期胚胎单细胞测序, 可以进行遗传疾病预测, 有助于生殖健康。北京大学的生殖医学团队开发了单倍型分析方法─scHaplotyper, 追踪胚胎中每个单倍型区域的起源, 从而检测每个胚胎中疾病等位基因的携带状态, 并且成功在临床上对有遗传疾病史的家庭进行健康胚胎筛查。产前诊断方法学的进步, 对遗传疾病预防和诊断具有重要意义, 是健康生殖的助力。

3.1.4 辅助生殖

单细胞测序技术具有可以精确检测少量细胞的优势, 可被应用于产前诊断。MALBAC是临床生殖医学中最成功的单细胞测序应用技术之一, 基于MALBAC的胚胎植入前体外受精基因组筛选技术使胚胎移植时能够准确、经济地选择正常受精卵。通过单细胞测序检测受精卵或胚胎细胞, 选择健康的胚胎进行移植, 可降低先天性遗传疾病新生儿的出生率, 有助于预防遗传疾病。结合了单细胞测序技术的产前诊断方法提升了胚胎移植前的筛选效率, 避免将突变基因和遗传疾病传给后代。

3.2 肿瘤方面应用

3.2.1 肿瘤基础研究

单细胞测序技术在揭示肿瘤异质性问题上存在独特的优势，能发现肿瘤细胞的多种亚型，进而再对各类亚型细胞的性质进行分析比较，为肿瘤异质性的进一步解决提供了可能，也促进了精准治疗的推广。多年来，有关恶性肿瘤发病机制及演变过程的研究颇多但具体机制尚未明确。诸多研究利用单细胞测序技术鉴定出一些在肿瘤发生发展中发挥关键作用的细胞亚群及异常基因。

单细胞测序技术能鉴别出一些肿瘤细胞特有的突变基因，有助于挖掘肿瘤发生、转移的潜在关键因子，也为判断是否有转移或复发的高风险提供了理论依，有潜在的临床应用价值。单细胞测序技术全面地展现了肿瘤微环境中各组成部分的特有特征，并明确肿瘤细胞与微环境各组分之间的相互作用，尤其是肿瘤与免疫细胞的关系，有助于探索肿瘤免疫治疗的潜在新靶点。

3.2.2 肿瘤临床诊断

传统的测序方法是对大量的混合细胞进行测序，把大量混合细胞的遗传信息进行平均化，忽略了各种类型的细胞之间的区别。单细胞测序技术可以更明确细胞水平的异质性，有利于分析组织中数量较少细胞的遗传信息和异质性较大肿瘤的特征。

3.2.3 肿瘤临床治疗

单细胞测序技术可对肿瘤耐药细胞进行谱系追踪，为肿瘤耐药的靶向治疗提供理论基础，进而明确肿瘤分型、指导治疗，为恶性肿瘤的精准化、个性化治疗带来新希望。

3.3 干细胞方面应用

造血干细胞在人类疾病治疗等领域的应用中具有其独特地位，深入了解造血干细胞命运调控网络和机制，寻找造血干细胞命运变迁的关键调控节点基因，一直是各国科学家追逐的目标。通过单细胞测序技术，可以更加精确地对造血干细胞的稳态维持、发育分化和疾病转变的基因的表达情况进行动态监控，获得可能调控造血干细胞命运的关键节点基因。通过基因编辑技术，对可能影响造血干细胞命运的基因进行功能注释，以明确影响造血干细胞的调控因子。通过基因编辑可以对病人来源的造血干细胞的突变基因进行校正，体外扩增，再回移至病人体内，可以实现病人的个体化精准治疗。此外，体外运用基因编辑校正

的造血干细胞，可以通过基因工程动物模型进行功能和安全性评价，并利用单细胞测序评价校正后造血干细胞移植后的掺入比例和功能性分析。

3.4 免疫性疾病方面应用

3.4.1 探索免疫机制

免疫反应的效率取决于参与免疫过程中高异质性免疫细胞的协同。单细胞技术可用于分析免疫细胞亚群和细胞间网络，探索免疫系统作用机制以及不同个体、物种的差异。例如：

1、利用单细胞技术探索不同组织免疫细胞的特征。对肺、淋巴结、骨髓和血液中分离的人类T细胞进行scRNA-seq发现，免疫细胞具有高异质性和不同的功能反应，不同组织位置上人类T细胞的持久性和功能各具差异。对斑马鱼的免疫成分单细胞研究为群体进化的研究提供了参考。利用单细胞技术发现新细胞类型和细胞状态。

2、对数百个扁桃体先天性淋巴细胞（ILC）和自然杀伤细胞（NK）进行单细胞转录组测序发现，细胞可分为 ILC1、ILC2、ILC3 和 NK 四类，而 ILC3 细胞亚群可以被继 续分为三个亚群。Villani 等人对健康人细胞的 scRNA-seq 发现，占比2-3%的树突细胞亚群可以进一步区分为浆细胞样树突细胞和CD1C+传统树突细胞。

图20.免疫学中的单细胞基因组学

3.4.2 免疫性疾病研究

观察免疫细胞在健康和病理环境中的组成和发展轨迹，有助于了解人类疾病的发生和发展。对脾脏和血液进行 scRNA-seq 发现，小鼠和人在器官和物种之间存在相似性，为利用小鼠来研究人类生理学和疾病奠定了理论基础。炎性肠病（IBD）患者结肠间充质细胞的scRNA-seq数据，确认了肠间质通过重塑而促进了IBD炎症和功能障碍。Lonnberg基于scRNA-seq重建了疟疾模型小鼠Th1和Tfh细胞的发育轨迹，并证明了 Galectin-1（半乳糖凝集素1）在支持Th1分化中的T细胞内在作用。此外，针对一些药物适用于多种免疫性疾病的现象，单细胞技术有助于了解不同免疫性疾病之间的共性。

3.4.3 免疫性疾病临床诊疗

免疫性疾病的单细胞研究可以为临床诊断和治疗提供重要的理论依据。Yu Y 等人对小鼠骨髓祖细胞进行单细胞RNA测序[Yu Y et al. Nature. 2016]，发现了PD-1高表达的先天性淋巴细胞（PD-1hi- ILC）。在小鼠流感感染模型中注射缺乏PD-1抗体的PD-1hi-ILCs后，细胞因子水平降低并阻断了木瓜蛋白酶诱导的急性肺部炎症。对小鼠和人关节炎模型的scRNA-seq数据研究中发现，多细胞类型的网络中心具有丰富的与关节炎相关的基因变异，可以优先作为靶点[Gawel, D et al. Genome Med 2019]。结合单细胞基因组学、新兴的空间方法、免疫组库分析、多重免疫表型以及已建立的功能分析方法，将从根本上改变对感染、自身免疫、过敏和炎症中免疫功能和功能障碍的认识，并推动治疗进展[Stubbington MJT et al. Science. 2017]。

3.5 早期诊断方面应用

单细胞主要运用于癌症的早期诊断，在肿瘤转移过程中，癌细胞从原发肿瘤脱落，进入血液或淋巴循环系统，其中一些具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，成为循环肿瘤细胞胞（Circulating Tumor Cell, CTC），癌症病人血液中 CTCs 的计数已逐渐用于癌症治疗的疗效评估。如果能对 CTCs 进行基因组分析将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制；同时，作为一种非侵袭性的检测手段，CTCs 的基因组分析还可以为疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。然而，由于循环肿瘤细胞在病人外周血中存在的数量极其稀少，对其进行基因组测序具有较大难度。近年来随着单细胞测序水平的发展，通过多重退火和环化循环的扩增技术(MALBAC)实现了对于来自癌症病人外周血单个循环肿瘤细胞的全基因组扩增和深度测序，MALBAC 技术具有基因组扩增均匀，覆盖率高等众多优势，从而使得研究人员可以在单个细胞水平准确探测全基因组基因拷贝数变异(CNVs)和单核苷酸变异(SNVs)，从而实现对癌症的早期诊断，疗效检测与预后评估。

3.6 靶点发现方面应用

在癌症研究中，单细胞测序也逐渐起到了十分重要的作用，运用单细胞测序手段，人们对于癌症的发生发展有了更为深入的认识，其运用方面包括检测一些癌症相关的细胞类群，这对于研究癌症的发生发展有十分重要的作用，运用单细胞测序得到了肺癌相关新的标志物和界定了新的疾病类群。

04
国内外公司融资及并购事件

4.1 10X Genomics

10X Genomics是一个美国基因测序技术服务平台，主要为用户提供Chromium系统，该系统适用于单细胞基因表达谱分析、单细胞免疫分析、外显子组测序、基因组测序等领域。10X Genomics的chromium也是目前市场占有率最高的单细胞测序商业化平台。

10X Genomics的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2019.09.12	IPO	3.33亿美元	公开发行
2	2018.04.26	D轮	5000万美元	Meritech Capital 富国银行 Paladin Capital Group Fidelity Investments 软银集团
3	2016.03.17	C轮	5500万美元	Paladin Capital Group Venrock Fidelity Management and Research Foresite Capital
4	2015.01.12	B轮	5500万美元	/
5	2012.10.08	A轮	300万美元	/

10X Genomics的并购事件如下：

序号	时间	收购公司名称	业务发展
1	2018	Epinomics	该公司专注于表观遗传学领域。这一收购为10x Genomics带来ATAC-seq技术和相关知识产权。
2	2018	Spatial Transcriptomics	该公司位于瑞典，专注于空间基因组学技术。空间基因组学技术也为肿瘤学、神经科学和免疫学等疾病领域提供了丰富的可能性。本次收购可扩充该领域管线。
3	2020	ReadCoor	来自哈佛大学 George Church 教授的实验室，目前该公司已凭借其核心技术荧光原位测序（FISSEQ），在肿瘤、传染病和神经科学领域中有所应用，可以用来帮助研究的顺利进行、药物的开发和临床诊断。FISSEQ 技术结合了下一代测序（NGS）和高分辨率成像技术，测定 RNA、DNA 和蛋白质。这些测定结合在一起，可以实现在单个样品中进行空间多组学测量。 本轮收购扩大了 10x Genomics 在原位测序技术上的布局。
4	2020	CartaNA	来自斯德哥尔摩大学 Mats Nilsson 教授的 SciLife 实验室。其原位 RNA 定序技术能帮助研究人员分析新鲜 / 冷冻固定的 FFPE 样品，并且快速建立多达数百个基因的单细胞基因表现图谱，可确保高特异性、高通量、可靠以及可再现的数据。 本轮收购扩大了 10x Genomics 在原位测序技术上的布局
5	2021	Teramer Shop	Teramer Shop成立于2019年，从丹麦技术大学分拆出来的企业，技术源自德国雅各布大学（Jacobs University）。公司总部位于丹麦哥本哈根，创始团队是一群资深的免疫学家。Tetramer Shop致力于为全球客户提供服务，支持学术研究机构及医学研发实验室在肿瘤疫苗、T细胞治疗等领域的研发工作。其推动高性能MHC四聚体的广泛应用，支持对抗原特异T细胞进行更快速、更高效、更经济的检测和监控，目前开发了一系列四聚体产品，其中包括COVID-19的T细胞表位筛选四聚体。 本轮收购以进一步拓展十程基因在免疫组学方面的服务能力。

4.2 Becton,Dickinson and Company

自1973年为世界带来第一台商用流式细胞仪以来，BD 始终致力于成为流式细胞仪的领跑者及流式细胞术的领军者。公司已上市。

BD公司于2015年8月收购Cellular Research公司，从而推出了高通量单细胞转录组测序平台和数据分析平台BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System，基本原理前文已介绍。

4.3 Illumina

Illumina是一家领先的生命科学工具和综合系统开发、制造和营销商，其产品主要是二代高通量测序仪，也占据了目前二代测序仪的绝大部分市场份额。Illumina的产品让在几年前还不敢想象的研究得以顺利开展，使人们能更加靠近实现个性化医疗的目标。公司已上市。

Illumina的并购事件如下：

序号	时间	收购公司名称	业务发展
1	2020	Grail	癌症早筛
2	2020	Enancio	基因组数据压缩软件公司
3	2020	BlueBee	基因组分析解决
4	2018	Edico Genome	NGS数据分析
5	2016	Conexio Genomics	HLA分型
6	2015	GenoLogics	生命科学软件
7	2014	Myraqa	伴随诊断
8	2013	NextBio	基因组测试
9	2013	Advanced Liquid logic	微流样品处理
10	2013	Verinata	伴随诊断
11	2012	Blue Gnome	染色体筛选诊断
12	2011	Epicentre	核酸样品制备及处理
13	2010	Helixis	PCR仪器
14	2007	Solexa	测序平台

4.4 Bio-Rad Laboratories

Illumina和Bio-Rad在2017年的JP摩根健康大会上发布®了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。该系统利用Bio-Rad的液滴分离技术：Droplet Digital™技术，可以对单细胞进行隔离和编制条形码，完成单个细胞的捕获、经过扩增、表达谱建库，然后在Illumina NextSeq500仪器进行下游测序，从而获得单个细胞表达谱数据。该系统还可以使用BaseSpace® Informatics Suite，Illumina的云端基因组学计算环境进行初级和中级数据分析，使用流式细胞分析技术的领先公司FlowJo, LLC所开发的SeqGeq™进行高级数据分析和可视化处理。Single-Cell Sequencing Solution可以一次性处理8个样本，每个样品可以得到500—10000个细胞，能够在组织功能、病情进展和治疗反应方面等研究单个细胞的协同作用。与其他高通量捕获平台相比，捕获效率低，仅为3%。优点是成本相对低。

Bio-Rad的并购事件如下：

序号	时间	收购公司名称	业务发展
1	2020	Celsee	精密医学及单细胞分析领域
2	2017	RainDance	基于液滴的非侵入性液体活检鼠，PCR检测
3	2014	Gnubio	NGS检测
4	2012	ABD Serotec	抗体、免疫学世纪。
5	2011	Quantalife	数字PCR技术
6	2007	DiaMed	血型筛选系统

4.5 WaferGen Biosystems

2015年2月份，Wafergen公司开发ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台，具有通量高，周期快等特点，解决了传统单细胞扩增中通量低，价格贵的问题，在大量细胞的捕获筛选过程中提供了高效的平台。但是，细胞的捕获只有效率30%，成本相对较低。该系统基于微流控芯片的技术，利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选，5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备，经过扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，可快速得到样本间的基因表达差异。公司2016年被TAKARA BIO以数百万美元价格并购。

4.6 Mission Bio

Mission Bio成立于2012年，是加州大学旧金山分校(UCSF)研究工作的衍生项目。该公司推出了"第一个也是唯一一个"平台Tapestri，能够在单个细胞中对DNA和蛋白质进行测序，从而为精密医学识别更准确的癌症靶标。到2025年，多组学市场规模预计将达到50亿美元，Mission Bio领先一步，因为Tapestri平台现在是第一个也是唯一一个同时检测来自同一细胞的单核苷酸变体（SNV）、拷贝数变异体（CNV）和蛋白质的单细胞多组学平台。

Mission Bio的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2018.07	A轮	1000万美金	Mayfield Fund Tech Coast Angels StartX Keiretsu Forum Life Science Angels
2	2018.12	B轮	3000万美金	Agilent Technologies, Cota Capital LAM Capital Mayfield
3	2020.08	C轮	7000万美金	Novo Growth Mayfield Fusion Fund Cota Capital Agilent Soleus Capital

4.7 新格元生物科技有限公司

新格元生物科技有限公司致力于将突破性的单细胞分析技术应用于临床检测、健康管理和药物开发领域。公司与耶鲁大学签署了微流控单细胞处理专利的全球独家使用协议，并利用该专利联合自主知识产权的单细胞扩增技术开发出基于微流芯片的创新性GEXSCOPE®单细胞技术平台，突破了常规单细胞测序技术在周期、通量和成本等方面的瓶颈，为单细胞分析技术在临床检测上的应用扫除障碍。公司致力于自主开发创新技术，已申请仪器及微流控系统设计、单细胞扩增和建库方法流程、数据分析算法等方面的20余项发明专利，并获得42项软件著作权。于2019年1月推出国内首个海量单细胞转录组测序产品，包括微流芯片、试剂、生物信息分析软件的完整解决方案。并于2020年推出国内首个自动化单细胞测序前处理仪器—Singleron MatrixTM。

新格元生物的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2020.12.24	A++	近3000万美元	腾讯投资 礼来亚洲基金 夏尔巴投资 鼎晖投资 软银中国资本
2	2020.11.11	A+	超千万美元	软银中国资本 晨岭资本 鼎晖投资 礼来亚洲基金
3	2020.09.06	A	3000万美元	礼来亚洲基金 鼎晖投资 Arch Venture Partners 腾讯投资 国新国信东吴海外基金 夏尔巴投资 华创资本
4	2019.06.20	Pre A	近亿人民币	夏尔巴投资 华创资本 峰瑞资本 元禾原点
5	2018.05.17	天使轮	数千万人民币	元禾原点 峰瑞资本

4.8 上海宸安生物科技有限公司

上海宸安生物科技有限公司已自主研发出国内首台质谱流式设备，可在单细胞水平进行高通量蛋白质组和转录组分析，能评估肿瘤、免疫系统和治疗体系的相互作用。由于国内质谱流式技术落地尚处于起步阶段，未有自主研发的系统产品上市，宸安生物的布局位于市场前列。公司已与上海、北京、广州等地区的多家大型三甲医院展开肿瘤领域的合作。

宸安生物的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2020.06.24	B	7000万人民币	德联资本 火山石资本 百度风投 ETP道康致和 华莱坞投资 盛鼎投资 五源资本
2	2020.06.08	股权融资	未披露	盛鼎资本
3	2019.09.05	A+	数千万人民币	百度风投
4	2019.01.19	A	825万美元	ETP道康致和 五源资本 火山石资本
5	2018.03.26	天使轮	未披露	火山石资本 普华资本 树兰医疗
6	2016.12.02	种子轮	未披露	道彤投资 树兰医疗

4.9 万乘经纬基因科技（北京）有限公司

万乘基因拥有国际先进的高通量单细胞多组学技术，公司秉持将单细胞分析从实验室技术提升为标准化工业级产品的理念， 致力于降低单细胞研究的技术门槛，专业为广大科研工作者提供高质量的单细胞技术与服务。

万乘基因的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2021.02.04	Pre-A	数千万人民币	北极光创投
2	2019.03.22	天使轮	500万人民币	合力创投

4.10 上海序康医疗科技有限公司

序康医疗·亿康基因成立于2012年，是一家致力于开发及应用单细胞全基因组扩增及测序技术，为生育健康和肿瘤诊断提供优质的医学检测服务的高新技术企业。亿康医学检验所获得了上海市及苏州市卫计委颁发的《医疗机构许可证》，可为国内外医疗机构、科研院所、集团及个人提供生殖遗传、妇幼健康、肿瘤筛查与检验、生命科学研究等领域的近百项检测服务。2017年6月，序康医疗·亿康基因PGS试剂盒通过CFDA创新医疗器械特别审批。

上海序康医疗科技有限公司的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2021.05.06	D	2.5亿人民币	通用创投 云锋基金 国药资本 元禾控股 苏州基金 中金资本
2	2020.10.20	战略融资	未披露	国方资本 中金资本 世纪金源集团 盛山资产 金垣坤通 中金前海发展基金
3	2019.11.04	C	2.2亿人民币	金阖资本 中元九派 交银国际 越秀产业基金
4	2017.03.29	B+	未披露	新产业创投 宏瓴资本
5	2016.09.09	B	1.4亿人民币	新产业创投 海利生物 海利生物董事长张海明 通和毓承 国科嘉和 越秀产业基金
6	2015.08.17	A	2000万人民币	通和毓承

4.11 北京寻因生物科技有限公司

寻因生物专注于高通量单细胞多组学平台产品的自主开发及临床转化。公司成立后发展迅速，以SeekOne®高通量单细胞建库平台以及SeekPair®免疫单细胞受体-抗原匹配平台为主要研发方向。日前，SeekOne® MM（Microwell & Magnetic Beads）单细胞转录组建库试剂盒已完成批量对比测试，系列产品在主要指标上均达到了国际领先水平，正式开始商业化应用，并于2020年底启动了“SeekOne®人类单细胞注释基线计划” 。

寻因生物的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2021.01.08	A	亿元人民币	博远资本 辰德资本
2	2019.10.28	Pre-A	数千万人民币	德联资本
3	2018.11.13	天使轮	未披露	真格基金

4.12 北京百奥智汇科技有限公司

百奥智汇是一家具有全球视野的生物技术企业，公司具备国际前沿的单细胞测序技术，开发了快速、高效的单细胞组学分析方法，建立了国际上先进的单细胞组学数据库和交互性单细胞数据展示平台，拥有多项单细胞生物信息技术专利。百奥智汇致力于单细胞基因组学和生物信息学在人类疾病诊断和治疗上的应用，发现新的治疗和诊断靶标、创新治疗策略，创建人类疾病的精准图谱。通过应用和挖掘人类单细胞疾病图谱，百奥智汇将成为新时代新药研发的发动机。

百奥智汇的融资历程如下：

序号	日期	轮次	融资金额	投资机构
1	2021.05.25	A++	未披露	红杉资本中国 IDG资本 松禾资本 春华创投
2	2021.02.09	战略融资	未披露	百图生科
3	2020.12.29	A+	未披露	软银中国资本 IDG资本 杏泽资本
4	2019.06.27	A	未披露	IDG资本

05
单细胞测序技术亟待解决的问题

5.1 成本仍然较高

单细胞测序的实验流程较为复杂，且产业链上游的设备和试剂厂商比较集中，形成了较强的议价能力，因此给下游服务商、应用开发商和终端用户都造成了一定的成本压力。这导致单细胞技术无法被大规模使用。例如对于由大量细胞组成的组织，成本限制会使研究者牺牲样品的完整性，妥协次要的技术参数，故而一定程度上会影响研究的质量，难以得到全面的、高质量的精细细胞图谱；而对于稀有细胞的检测也同样面临着单个细胞的研究成本过高的问题，难以放大研究规模。

5.2 设备依赖和时效性

单细胞测序技术在转化应用上的难点主要体现设备依赖和时效性的矛盾上。一方面，单细胞的捕获和建库流程完全依赖特定设备导致单细胞建库门槛较高，并最终体现在成本上。另一方面，单细胞测序对样品的细胞活性和数量都有着比较高的要求，需要样品离体时间不能过长，有一定的新鲜度，且不能冷冻保藏，如此对样品处理的时效性提出了极高的挑战。在中心化检测模式下，虽然大规模集中检测可以均摊仪器和试剂的成本，但对样品的新鲜保存和快速寄送提出了很高的要求；而在去中心化的终端检测模式下，虽然样品的细胞活性和数量得到了保障，但高昂的仪器和试剂采购成本往往会让研究者望而却步。

自动化工作流程：传统的单细胞检测方法主要是通过组装的开放式系统来生产数据，即通过微流控系统、试剂盒，各种技术模块组合起来生产数据。目前，国内大多数服务商和应用开发商均以这种方式主自建产品、流程或提供服务。相比之下，BD、10xGenomics等公司推出的一体机，不仅操作简单，容易学习，还能减少人为操作带来的潜在错误和偏差，因而市场占有率较高。显然，对于实验流程不熟悉、技能和经验都比较缺乏的终端用户，易于操作的一体化仪器自然显得更为友好。

5.3 细胞分离和捕获效率

细胞分离过程要尽可能地保持细胞活性，减少对细胞转录组的影响，从而确保实验的成功率和数据的高质量。目前，市场上现有设备的细胞捕获效率还参差不齐，很多设备的捕获效率还有待提高，初始细胞数量要求还需降低，从而提高检测的有效率和灵敏度等，这对于诸如肿瘤穿刺样品在内的许多珍贵样本都尤为重要。

5.4 生物信息学分析

目前常用的标准生信分析流程能对单细胞转录组测序的数据进行基础的分析，但还无法胜任细胞时序发育推断、细胞间相互作用预测、以及多种单细胞技术联合分析及内涵挖掘等复杂的分析工作，导致不少单细胞研究还停留在基础的数据堆砌阶段。此外，许多创新的、突破性的研究往往需要根据研究目的进行专门的算法设计和优化，这就需要大量的高素质生信人才的投入，但遗憾的是，目前这样的高端人才资源在市场上还非常缺乏。

06
单细胞测序技术的展望

目前商用高通量单细胞转录组的研究策略主要基于3′端单细胞转录组测序。虽然这种方式可以检测到mRNA和部分带ploy(A)尾的长链非编码RNA，但是还有大量存在的非ploy(A)尾长链非编码RNA有待于通过5′端单细胞转录组的推广而得以检测。另外，单细胞转录组测序还没有对单个外泌体内包含的分子进行检测，这也是未来发展的一个方向。

现有单细胞转录组检测技术基于将组织细胞进行解离后进行后续实验，因此，失去了细胞在原有组织中的空间位置。基于保留细胞原有物理位置的空间转录组检测将是一个新的、运用更广的方向。现已发展的空间转录组技术有基于原位高分辨率的SeqFISH (sequential fluorescence in situ hybridization)、MERFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)、ISS (in situ sequencing)技术和基于空间Barcode标记的高通量ST (spatial transcriptomics)技术。10X Genomics的Visium技术基于ST技术原理，虽然该技术不是真正意义上的单细胞空间转录组测序技术，但通过6.5 mm × 6.5 mm的捕获区域，可实现5 000个spots (每个spot直径为55 μm)的捕获分辨率。在最新的研究中，新开发的HDST (high-definition spatial transcriptomics)已将ST技术的空间分辨率提升到2 μm，实现了真正意义上的高通量单细胞空间转录组检测。

目前的单细胞转录组研究通常基于二代测序平台，从短读长入手揭示基因表达的变化。转录本可变剪切分析是研究特定时空转录的特异性与特定表型的关联的基础。基于三代测序长读长优势，有研究已实现了单细胞转录组可变剪切识别与分析。这将拓宽现有单细胞转录组的研究广度和价值。

除了单细胞转录组和空间转录组检测，一些新的研究已经实现了从单个细胞入手来进行基因组检测、DNA甲基化检测、染色质开放性检测(assay for transposase-accessible chromatin, ATAC)。因此，将这些不同层面的数据进行整合，为从更高的层次去理解细胞的功能提供了可能。近来的研究已开发了一些多组学整合分析工具：LIGER (linked inference of genomic experimental relationships)是用于基因表达、表观调控和空间位置整合分析的新方法。Seurat V3实现了基因表达与表观调控、蛋白质组学和空间转录的多组学分析。因此，基于单细胞的多组学研究也将是未来的发展方向之一，也被Nature Methods评为了2019年度技术进展。总体来说，高通量单细胞转录组测序技术正以迅猛的发展势头被生命科学研究所广泛运用。未来，高通量单细胞转录组研究也会为科学研究带来更多的成果和产出。

参考文献

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往期回顾

经纬行研 | 柳暗花明又一村：siRNA药物的诞生之路（上）

图文编辑 | 马晴晴

文章撰写 | 高超、吴昊、刘啸波、焦瑞、程遥、王盼、魏欣