[新书连载] 脑胶质瘤干细胞耐药的特点 | 刘福生《脑胶质瘤基础与临床研究》第18期
第十章：脑胶质瘤的化疗与耐药
第一节 脑胶质瘤耐药机制研究
二、 脑胶质瘤干细胞耐药的特点
(一) 耐药相关基因及其蛋白的表达及意义
1、P¯糖蛋白 (P¯glycoprotein P¯gp)
MDR 基因包括 MDR1 与 MDR2 其中仅 MDR1 产生耐药表型 MDR2 的功能尚不清楚 MDRl 基因 定位于 色体 7q21 1 产物是相对分子质量为 170kD 的跨膜磷脂糖蛋白 即为 P¯ gp 该糖蛋白的表达 和细胞膜的通透性、 细胞内药物浓度以及细胞耐药程度有关 作为ATP依赖型药物的排出泵 (ATP¯de¯ pendent drug efflux pump) P¯ gp 能够泵出各种药物如秋水仙碱、 依托泊苷、 多 比星和长春新碱等化疗 药物 使细胞内药物浓度不断下降 从而导致耐药性产生 大多数的研究认为 P¯ gp 通过外排转运机 制将通过细胞膜的亲脂性药物泵出细胞外 从而降低化疗药物作用效果 另一种观点认为 P¯ gp 转运 体起翻转酶的作用 可将其底物从胞内转运到胞外或者局部改变膜脂结构而清除底物 研究发现 P¯gp 过度表达可导致细胞碱性增强 改变细胞内离子环境 从而降低细胞对多种诱导凋亡的化疗药物的敏感 性 此外 P¯ gp 还可以在血管内皮细胞中表达参与血脑屏障而阻止药物进入脑组织 但是 MDR1 基因 过表达与肿瘤的临床耐药特性无直接关系 这种耐药机制不是导致肿瘤耐药性的主要机制 还有非 Pgp 介导的多药耐药性机制存在。
2 、多药耐药相关蛋白 (multidrug resistance associated protein MRP)
MRP 被称为非 P¯ gp 介导的 MDR 在不表达 P¯ gp 的多药耐药细胞中可以检测出 MRP 人类 MRP 基 因家族现已有 9 个成员 其中 MRP1 发现最早 研究最深 并且与多药耐药关系最密切 MRP 是一种非 钠依赖性需ATP供能的药物输出泵 不仅能特异地转运疏水性的细胞毒药物 还可与GSH (glutathione 谷胱甘肽) 形成谷胱甘肽¯ S¯ 共轭物转运泵 ( GST¯ X 泵) 间接转运弱碱类抗癌药物 此外 MRP 不但 定位于血浆细胞膜 而且存在于内质网、 高尔基滤泡处 提示 MRP 还可在细胞内隔离药物 使药物不 能与靶位点结合 从而间接导致耐药 MRP 表达引起耐受的药物主要是顺铂及依托泊苷 。
3、 肺癌耐药性相关蛋白 (lung resistance¯related protein LRP)
LRP 基因 cDNA 全长 2 8kb 含 896 个氨基酸 95% 的 LRP 位于细胞质中 5% 位于核膜的胞质面和 核膜孔附近 LRP 与 MVP (major vault protein MVP) 高度同源 而 MVP 是构成穹隆小体 (vault) 的 主要成分 LRP 在肿瘤 MDR 中的作用也是依赖 ATP 能量 使药物外排 使胞内药物浓度降低 减少细 胞毒作用 其可阻止某些以细胞核为效应点的药物通过核膜孔进入细胞核 并将进入细胞核的药物转运 到细胞质中 再将进入细胞质中的药物转运到运输囊泡中 从而隔绝药物作用 并以胞吐的方式排到细 胞外 LRP 阳性肿瘤耐药细胞耐药谱广泛 主要是介导以 DNA 为靶点的化疗药物 如卡铂、 顺铂等。
4、 乳腺癌耐药相关蛋白 (breast cancer resistance protein BCRP)
BCRP 也属于 ATP 结合盒转运蛋白超家族 能排除 20 多种细胞毒性药物 包括米托蒽醌、 红霉 素、 多 比星和托泊替康等 从而影响药物发挥作用 研究发现 BCRP 在胶质母细胞瘤血管和实质组 织中均有高表达 并且在高级别胶质瘤中 BCRP 表达水平比 42 35156 42 14941 0 0 1755 0 0:00:20 0:00:08 0:00:12 2851低级别胶质瘤高 因此这可能是导致高级别 胶质瘤预后差的重要原因。
5 、谷胱甘肽 S 转移酶 ( glutathione S¯ transferases GSTs)
人类编码 GST 的基因由于其多态性可分为 8 种 GSTα、 μ、 π、 θ、 β、 δ、 ε 和 ω 研究较多的是前 四种 分别编码 GSTA、 GSTM、 GSTP 和 GSTT 4 个亚家族蛋白 与化疗药物结合 参与生理解毒 降低 化疗药物的毒性 导致肿瘤细胞产生耐药性 GST 介导的耐药机制目前认为主要有: 1催化巯基谷胱甘 肽 (GSH) 与多种有害物质包括抗肿瘤药物结合 使药物对细胞的毒性降低ꎻ 2GST 可以将 GSH 耦联 到化疗药物上 加速其外流 减少细胞毒性ꎻ 3GST 自身也可与亲脂性药物结合增加其水溶性 从而促 进其外排 GST 除了可以直接与药物结合达到排毒的作用外 还可以通过影响与细胞增殖、 凋亡相关的 信号传导通路 间接调控肿瘤的耐药 目前已证实与 GST 相关联的蛋白包括: c¯ jun 氨基末端激酶 JNK 凋亡信号调节酶 ASK1、 PKA、 PKC 以及 EGFR 等 这些蛋白均是细胞增殖凋亡信号传导通路上的关键 蛋白 GST 可通过与这些蛋白相互作用 来影响肿瘤细胞的生长 。
6 、拓扑异构酶II (topoisomerase II Topo II)
Topo 有两种同工酶 其中 TopoI可使 DNA 单键断裂并瞬间连接 无需 ATP 供能ꎻ 而 TopoII则能够 使 DNA 双键断裂并瞬间连接 但需 ATP 供能 TopoII是肿瘤化疗的重要靶点 主要介导 DNA 的断裂反 应并形成 DNA—酶复合物 但此反应是可逆的 且趋向与断裂的 DNA 再联接 TopoII介导的 MDR 的主 要特征有: 1对许多天然药物呈现抗药性ꎻ 2不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用ꎻ 3药物在细胞内积聚 与保留没有变化ꎻ 4P¯ gp 表达未见增加ꎻ 5Topo II含量及活性均有所下降 当肿瘤细胞的拓扑异构酶 发生改变时 肿瘤细胞会对抑制拓扑异构酶的抗肿瘤药物产生耐药 临床上 Topo II表达水平低的胶质 瘤患者预后比高表达者差 部分说明了拓扑异构酶的缺失参与了耐药。
7 、金属硫蛋白 (metallothioneins MT)
MT 是一种被诱导合成 并能结合多种重金属及相对分子质量特殊的非酶蛋白质 可以与一系列重 金属结合 形成螯合物贮存在细胞内 防止它们对膜系统、 酶类及细胞内其他敏感组分的毒性作用 此 外 还可消除自由基和超氧自由基 从而在重金属解毒和维持细胞内环境稳定方面起重要作用 机体环 境变化及某些化疗药物可诱导其合成 研究表明 MT 可以降低顺铂的细胞毒作用 与许多肿瘤化疗耐药 有关。
8、p53基因/蛋白
p53 基因是一种典型的抑癌基因 其编码产物属一种转录因子 具有两种构型 野生型 p53 基因 ( wt¯ p53 gene) 和变异型 p53 基因 ( mt¯ p53 gene) 其发挥作用机制主要有: 细胞 DNA 受损后 wt¯ p53 可以抑制细胞由 G1 期进入 S 期 为细胞修复 DNA 赢得时间 如果细胞受损 DNA 修复失败 wt¯ p53 将 直接诱导细胞凋亡 当 wt¯ p53 缺失或发生基因突变 则不能正常诱导肿瘤细胞凋亡 进而引发肿瘤细 胞耐药 Blough (2007) 等通过基因敲除或 RNA 干扰方法使 p53 基因失活 结果 MGMT 的表达下调 进而影响替莫唑胺引起的耐药 。
9、 Bcl¯2基因/蛋白
B细胞淋巴瘤白血病2基因 (Bcl¯2) 家族属于调控细胞凋亡基因家族 分为抑凋亡基因 (包括Bcl¯ 2、 Bcl¯xl、 Bcl¯x、 A¯l、 Mcl¯1、 Bhrtl、 Bn¯1等) 及促凋亡基因 (包括Bcl¯xs、 Bax、 BadBak、 Hrk、 Bim 和 Bnip¯3 等) 两类 与传统的耐药机理不同 Bcl¯2 不阻止药物进入细胞内 不抑制药物引起的 DNA 损伤 也不改变细胞对 DNA 的修补速率和细胞周期动力学 Bcl¯2 过度表达时 药物照样进入细胞并引 起损伤 但这种损伤被转为无效死亡信号 导致肿瘤细胞不死或死亡率明显下降 Bcl¯2 通过抑制凋亡 使肿瘤细胞产生耐药 因此被认为是一种新型的耐药基因
10、 MGMT 基因
MGMT 基因位于 10q24 33¯ qter 编码相对分子质量为 22kD 的酶蛋白 参与胶质瘤的耐药性形成 为反映胶质瘤疗效的重要参考指标 MGMT 的蛋白表达可以被表观遗传修饰 同时 色体的缺失、 基因 突变及蛋白磷酸化都会控制其蛋白水平变化 研究证实 MGMT 是胶质瘤组织耐受烷化剂类抗癌药的主 要原因 MGMT 表达阴性的胶质瘤患者化疗效果明显优于 MGMT 阳性者 近年研究发现 MGMT 启动子 的甲基化与 MGMT 蛋白表达关系密切 启动子甲基化在 MGMT 基因中较常见 多发生在 MGMT 基因启 动子 CpG 岛 能导致该基因转录停止 蛋白表达减少 有研究通过启动子超甲基化介导的 MGMT 基因 沉默可以作为用替莫唑胺治疗的患者受益的标志 因此 MGMT 启动子的甲基化可作为预后的参考因 素 也可用于预测临床上采用替莫唑胺治疗是否有效
11、 核苷切除修复 (nucleotide excision repair NER) 基因
NER 是细胞内存在的一个最重要 DNA 修复方式 对于紫外线、 多种化学物质等外因导致的 DNA 损 伤以及在铂类、 烷化剂等形成的 DNA 修复过程中 NER 发挥着重要的修复功能 目前研究最多的与胶 质瘤耐药相关的核苷酸切除修复基因有 ERCC1 和 ERCC2 分别被证实与氮芥类及顺铂的耐药相关 由 于 MGMT 只能修复被化疗药烷基化的鸟嘌呤 防止 DNA 交连的形成 一旦 DNA 交连形成 则需 NER 来修复 所以 MGMT 与 NER 在肿瘤耐药中所起作用是互补的 。
12、 DNA 错配修复 (mismatch repair MMR) 基因
人类 MMR 由 Mut H、 Mut L、 Mut S 家族的蛋白组成 主要有 6 个蛋白质 即 hMSH2、 hMSH3、 hM¯ SH6、 hMLH1、 hMLH3 和 hPMLl 这些蛋白在校正摄取核苷酸错误 降低基因自发突变 加强 DNA 复 制保真性 维持微卫星稳定方面发挥重要调控作用 MMR 具有直接识别 DNA 损伤并诱导细胞凋亡的功 能 也可间接导致基因组微卫星不稳定以及增加一些基因突变 进而影响相关蛋白的表达 MMR 功能 缺失导致肿瘤的发生及肿瘤细胞对顺铂产生低水平耐受 近年研究发现 TMZ 诱导的细胞毒性依赖于 MMR 系统 MMR 功能缺失与胶质瘤耐药相关 但 Maxwell (2008) 等持相反的观点 认为 MMR 缺失与 胶质瘤对 TMZ 的耐药无关 。
13 、Micro RNA (miRNA)
Micro RNA 是一类长 20 ~ 25 个核苷酸序列的非编码的内源性单链 RNA 分子 与细胞增殖、 分化、 凋亡密切相关 胶质瘤中 许多 miRNA 表达失调并参与不同的信号通路 研究发现与正常脑组织相比 miR¯21 在恶性胶质瘤组织中明显上调 在肿瘤的凋亡、 侵袭、 扩增和耐药中发挥重要作用 同时 miR¯181 明显下调 miR¯21可通过降低Bax/Bcl¯2比值和caspase¯3的活性来降低TMZ诱导的凋亡活性 因此miR¯ 21 可能成为治疗 TMZ 耐药 GBM 的一种新靶点 其他 miRNA 成员如 miR¯ 195、 miR¯ 455¯ 3p 和 miR¯ 10a 也 已经被证实在胶质母细胞瘤中表达上调 miR¯ 196a 和 miR¯ 196b 还可以作为判断肿瘤预后的因子 。
主要作者简介：刘福生，教授，主任医师，研究员，博士研究生导师。首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心，北京市卫生技术高层次人才——神经外科学科带头人。
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