同济大学杜建忠教授课题组Macromolecules封面论文：完全非对称冠囊泡

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对称性是自然界的一个普遍现象，然而自然界中也存在一些对称性破缺，例如：有些生物两只眼睛有大有小，而比目鱼的眼睛甚至长在同侧；细胞膜双层成分的非对称性，保证了生命活动的高度有序性（图1）。因此，研究对称性破缺具有重要意义。

图1. 眼睛长在同侧的比目鱼（A）和细胞膜的非对称结构（B）¹

高分子囊泡是具有膜层、内冠、外冠结构的空心纳米球（图2），和细胞膜结构相似，在疾病诊疗、分子递送等领域具有重要的应用前景。然而，利用化学方法构筑的囊泡多为对称冠囊泡（图2），其内冠和外冠在结构和性质上完全相同，因此难以实现功能分区。而非对称冠囊泡则因具有不同的内外冠层，可实现功能分区。目前，非对称冠囊泡的制备方法主要包括两嵌段共聚物共组装、三嵌段或多嵌段聚合物自组装、乳液法等。然而，上述方法均不能保证内外冠层的100%的非对称性。具有完全不同的内冠和外冠结构的非对称冠囊泡，一直是高分子囊泡领域的一颗明珠，但是摘取她却困难重重。因此，如何构筑并表征完全非对称冠囊泡，仍是大分子自组装领域的一大挑战。

图2. 对称冠高分子囊泡示意图

为了解决上述问题，同济大学杜建忠教授课题组独辟蹊径，提出了一种胶束-囊泡转变法，构筑了完全非对称冠囊泡，并提出了相应的表征方法。该囊泡的构筑策略如图3所示。首先设计并合成了嵌段共聚物PEO₁₁₃-b-P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)-b-PDEA₂₈，然后自组装形成胶束，最终转变为非对称冠囊泡。其中，PEO始终作为亲水外冠；PDEA起初作为胶束的疏水内核，最终转变成非对称冠囊泡的内冠；P(NIPAM-stat-CMA) 起初作为胶束的中间冠层或壳层，最终构成非对称冠囊泡的交联膜层。由于PDEA内冠在血液循环过程中可转变为疏水的内壁，因此该囊泡可大幅降低抗癌药在递送过程中的泄露。

图3. 完全非对称冠囊泡的构筑策略

完全非对称冠囊泡的形成过程如图3所示：

（1）将聚合物直接分散在水中，自组装形成初始胶束Proto-micelle（25 °C，pH 7.0）；

（2）升温，胶束的中间冠层P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)脱水而转变为壳层，形成熟化胶束Mature micelle（40 °C，pH 7.0）;

（3）将P(NIPAM₄₅-stat-CMA₁₀)壳层进行适当的紫外交联以锁住胶束内核（该步骤是关键一步），形成交联的熟化胶束Cross-linked mature micelle;

（4）调节溶液pH至4.0，PDEA内核被质子化形成亲水的内冠，然后形成PNIPAM脱水的非对称冠囊泡Dehydrated asymmetric vesicle（40 °C，pH 4.0）。在该转变过程中，粒径由75 nm增加至108 nm，表面电势无明显变化（图4），表明PDEA始终被限制在非对称冠囊泡的内部空腔。

（5）降温至室温，形成粒径为230 nm的PNIPAM水化的非对称冠囊泡Hydrated asymmetric vesicle（25 °C，pH 4.0），同样地，其表面电势未发生明显改变，表明PDEA始终被限制在非对称冠囊泡的内部空腔。

图4. 胶束-囊泡的转变过程及囊泡膜层的水化过程

完全非对称冠囊泡的结构表征是另外一个难点。为此，作者提出了如下方法进行表征：

（1）完全非对称冠囊泡仅在内冠选择性沉积纳米金

采用原位载金的方式来定位内冠PDEA的分布，并以具有相同内外冠的对称冠囊泡作为对照，从而表征完全非对称冠囊泡的结构。图5所示的TEM图片表明金纳米颗粒选择性地生长在非对称冠囊泡的内部，表明PDEA仅分布于非对称冠囊泡的内部空腔；而在对照组对称冠囊泡中，金纳米颗粒在其内部和外部随机生长，表明PDEA分布于对称冠囊泡的内冠和外冠。

图5. 完全非对称冠囊泡和对称冠囊泡载金前后的TEM表征

（2）完全非对称冠囊泡在载金前后的表面电势均为负值

完全非对称冠囊泡在载金前后的表面电势分别为 -8 mV和 -6 mV，无明显改变。这表明带有正电荷的PDEA仅分布在非对称冠囊泡的内部，而PEO则始终分布在非对称冠囊泡的外部，具有电荷屏蔽作用。因此，载金前后非对称冠囊泡的表面电势基本不变；而在对称冠囊泡中，载金前后的表面电势分别为+23 mV 和 +14 mV，表明纳米金的原位负载消耗了对称冠囊泡外冠PDEA链段的部分正电荷，因此其表面电势随之降低（图6B）。

（3）完全非对称冠囊泡在载金前后具有较大的尺寸变化率

完全非对称冠囊泡的尺寸在原位载金后减小了18%。这是因为纳米金在PDEA内冠上的原位生长，消耗了其所带正电荷，导致PDEA内冠之间相互排斥作用减弱，非对称冠囊泡的粒径随之减小；而在对称冠囊泡中，PDEA在内冠和外冠中均有分布，纳米金的原位生长对其内部斥力的降低影响较小，故其尺寸变化率仅为4%（图6C）。

图6. 完全非对称冠囊泡和对称冠囊泡载金前后的表面电势及尺寸变化

上述非对称冠囊泡（25 °C，pH 4.0）在逐步调节pH至生理环境时（pH 7.4），PDEA内冠因亲水性降低而转变为内壁。这种由生理环境变化引起的形貌转变有望精确调控药物控释行为。在生理条件下，可将疏水性药物负载在疏水的PDEA内壁中，或者将亲水性药物包封于空腔中，即为药物穿上了一件“防渗衣”，可在递送过程中大幅降低药物泄露。而在到达弱酸性的肿瘤区域时，PDEA内壁因质子化而转变为亲水内冠，同时加速药物释放。如图7所示，载药非对称冠囊泡在pH 7.4的生理条件下释药速率很慢，48小时后的药物释放量仅为13.5%。而在pH 4.0的酸性条件下则表现出持续的药物释放行为，48小时内药物释放量达到71.4%。因此，该非对称冠囊泡有望作为一种新型的精准药物递送载体。

图7. 非对称冠囊泡可防止递送过程中的药物泄露

该成果以“Breaking the Corona Symmetry of Vesicles”为题发表在Macromolecules上（DOI: 10.1021/acs.macromol.1c00060，并当选为正封面（front cover）。同济大学博士生韦平是该论文的第一作者，杜建忠教授为通讯作者。

该项目得到国家杰出青年科学基金资助，感谢张江实验室国家蛋白质科学研究（上海）设施在冷冻电镜方面的支持。

论文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.1c00060

参考资料：

1. 比目鱼和细胞膜的图片来源于PNG素材网

http://www.pngsucai.com/png/6437243.html

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