尽管在过去十年中有多种新型抗肿瘤疗法被开发，兼备无创性和全身抗肿瘤能力的化疗仍是临床中肿瘤治疗的主要方法，但目前化疗的疗效还很不理想。此外，免疫抑制的肿瘤微环境（TME）也会限制化疗的疗效，导致肿瘤易复发转移。因此，探索可有效诱导肿瘤免疫原性的新化疗靶点，激活免疫系统并逆转TME的免疫抑制性，有望实现增强的治疗效果。
内质网作为细胞中调节蛋白质折叠和细胞稳态的重要细胞器，已成为新的药理学靶点。由于大多数肿瘤细胞都处于非致命的持续内质网应激状态，放大内质网应激可诱导肿瘤细胞凋亡。此外，当肿瘤中内质网应激程度异常增强时，定位在内质网上的免疫原性死亡（ICD）标志物钙网蛋白（CRT）会转移至细胞膜，熟化树突细胞（DCs）。因此，利用可放大内质网应激的药物促进CRT在细胞表面的暴露，可能是提升肿瘤免疫原性的理想选择。
近年来，基于“one-for-all”策略设计的兼备诊断和治疗功能的纳米药物被广泛开发用于影像引导的肿瘤治疗。例如第三代含磷树状大分子铜络合物（1G3-Cu），既可将促凋亡蛋白Bax转运至线粒体，诱导肿瘤细胞凋亡；还可利用Cu进行MR成像。此外，1G3-Cu对线粒体的潜在损伤可能导致另一种ICD标志物三磷酸腺苷（ATP）的释放，进一步增强ICD效应。
由于化疗药物往往受困于生物利用度差、单药疗效不足等缺点，具有优异载药能力的TME响应纳米平台被用于整合不同的药物以提高疗效。在众多纳米平台中，响应性聚合物胶束由于可负载疏水药物、延长血液循环时间以及控制药物释放等而具有独特的优势。然而，体内的多重生理屏障仍会阻碍胶束在肿瘤中的积累，因此有必要在胶束表面进行额外的仿生修饰以增强其肿瘤特异性。例如，具有免疫逃避性和同源靶向性的癌细胞膜可使纳米平台逃脱网状内皮系统的吞噬并增强其在肿瘤中的积累。考虑到对肿瘤的高效化疗可能会引起肿瘤细胞表面免疫检查点分子表达增加，将化疗与免疫检查点阻断（ICB）疗法结合将有望逆转免疫抑制的TME并产生长期抗肿瘤免疫记忆效应。
为了解决以上问题，东华大学沈明武/史向阳教授团队制备了细胞膜仿生、负载了1G3-Cu和内质网应激药物丰加霉素（Toy）的还原响应型聚合物纳米胶束用于化疗增强的肿瘤免疫治疗（图1）。研究团队首先利用含有二硫键的两亲性聚合物（PEG-SS-PCL）形成胶束，将1G3-Cu包封在其疏水空腔，并通过氢键作用负载Toy，最后在其表面包覆B16黑色素瘤细胞膜（CM），得到还原响应的聚合物纳米颗粒（GCT@CM NPs）。制备的纳米颗粒一方面可消耗GSH在肿瘤细胞内引起氧化应激，加重肿瘤细胞的内质网应激，同时利用Toy抑制内质网应激恢复稳态，使肿瘤细胞经内质网途径凋亡；另一方面还可利用1G3-Cu诱导线粒体功能紊乱，使肿瘤细胞经线粒体途径凋亡。此外，1G3-Cu与Toy可协同作用诱导肿瘤细胞发生ICD，激活抗肿瘤免疫响应。进一步将制备的纳米颗粒与PD-L1抗体联合使用，提高T细胞对肿瘤细胞的识别能力，恢复免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用，可产生长期、持续的免疫效应，有效抑制肿瘤的生长、转移或复发。
研究团队首先通过TEM和SEM等证明了GCT@CM NPs的成功合成（图2A-C），并且在NPs的表面保留了癌细胞膜表面的CD47蛋白用于免疫逃避（图2D）。制备的GCT@CM NPs由于CM的包覆而具有增强的抗蛋白吸附能力（图2E），并在水、PBS以及培养基中具有良好的胶体稳定性（图2H）。在不同浓度GSH条件下，GCT@CM NPs会响应性解离并释放Toy（图2I-J）。
图2.（A）GCT NPs的TEM图；GCT@CM NPs的（B）SEM图及（C）TEM图；（D）CD47蛋白的保留情况；（E）各材料的抗蛋白吸附能力；各材料的（F）水合粒径及（G）电势；（H）GCT@CM NPs在水、PBS以及培养基中的粒径变化曲线；（I）不同条件下GCT@CM NPs粒径的变化；（J）不同条件下Toy的累积释放曲线。研究团队通过细胞毒性实验及细胞吞噬实验证明，GCT@CM NPs对B16细胞具有增强的靶向性，可通过1G3-Cu与Toy的协同作用显著抑制B16细胞的活力（图3A-C）。并且，GCT@CM NPs可在细胞内消耗GSH、产生ROS，引起肿瘤细胞内氧化应激（图3D-G）。进一步实验结果表明，GCT@CM NPs通过氧化应激加重了内质网应激，并利用负载的Toy抑制了细胞内XBP1s的表达，从而通过加重内质网应激及抑制内质网应激恢复稳态使肿瘤细胞经内质网途径凋亡（图3I-M）。
图3.不同材料处理（A）B16细胞或（B）L929细胞后的细胞活力图；（C）不同材料处理B16细胞和RAW 264.7细胞后细胞内铜元素含量分析图；（D）不同材料处理后B16细胞内GSH水平分析图及（E-G）ROS水平分析图；（H）Toy在细胞内的作用机制示意图；（I-L）不同材料处理后B16细胞内相关基因的表达水平及（M）相关蛋白的Western blot试验结果图。随后，团队研究了GCT@CM NPs对细胞线粒体功能的影响。实验结果表明，制备的NPs可利用负载的1G3-Cu使线粒体膜电位下降，诱导线粒体功能障碍（图4A-B）。进一步研究发现，整合了Toy与1G3-Cu的GCT@CM NPs诱导了更多的细胞发生凋亡（25.68%），并且可使促凋亡蛋白Bax、p53及PTEN上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调（图4C-E）。此外，GCT@CM NPs可通过加重内质网应激使CRT外翻，通过线粒体损伤刺激ATP释放，从而在体外诱导肿瘤细胞发生ICD，并刺激DCs熟化（图4F-I）。
图4.（A）1G3-Cu在细胞内的作用机制示意图；（B）不同材料处理后B16细胞内线粒体膜电位变化分析图；（C-D）不同材料处理后B16细胞凋亡情况流式分析及（E）凋亡相关蛋白的Western blot试验结果图；（F）B16细胞与各组材料共孵育引起ICD，并刺激DCs熟化的示意图；不同材料处理后细胞内（G）HMGB-1的释放及（H）CRT表达情况分析图；（I）各组材料刺激DCs熟化的流式分析图。随后，研究团队在小鼠体内构建了B16皮下瘤模型，通过MR成像验证了GCT@CM NPs在体内具有肿瘤主动靶向性及延长的血液循环时间。在体内抗肿瘤实验中，GCT@CM NPs具有最佳的肿瘤抑制效果，可在体内诱导肿瘤细胞发生ICD，并招募细胞毒性T细胞进入TME。进一步将GCT@CM NPs与PD-L1抗体（Anti-PD-L1）联合使用发现，Anti-PD-L1可提高T细胞对肿瘤细胞的识别能力，使GCT@CM NPs+Anti-PD-L1组小鼠的肿瘤体积最小（图5A-E）。经流式分析发现，联合治疗使小鼠脾脏及肿瘤浸润的CD4+、CD8+T细胞比例显著上升，肿瘤部位Tregs的比例下降，免疫抑制的TME被逆转，表明化疗引起的ICD与ICB疗法联合可引起最有效的免疫应答（图5F-K）。
图5.（A）小鼠体内联合治疗过程示意图；不同材料治疗14天内（B）相对肿瘤体积变化图、（C）小鼠相对体重变化图及14天后的（D）肿瘤照片和（E）肿瘤重量；各实验组经治疗14天后，（F）脾脏及（G）肿瘤组织中CD8+与CD4+T细胞分型的流式细胞分析图及（H-I）肿瘤组织中Tregs的表达水平分析；（J）CD8+T细胞与Tregs的比值；（K）治疗后各组小鼠血清中IFN-γ表达水平分析。为了验证GCT@CM NPs+Anti-PD-L1的联合疗法在体内产生长期免疫记忆的能力，研究团队在联合治疗的基础上进行了肿瘤再挑战及抗转移实验（图6A）。研究发现联合治疗使小鼠脾脏中的记忆T细胞含量显著增加（图6B-C），并可在再次输入B16细胞后显著抑制再挑战肿瘤的生长以及肿瘤的肺转移（图6D-G）。
图6.（A）小鼠体内肿瘤再挑战及抗转移实验示意图；（B-C）经联合治疗后各组小鼠脾脏中记忆T细胞比例分析；（D）各组小鼠再挑战肿瘤中T细胞分型分析及（E）CD8+与CD4+T细胞的比值；（H）各组小鼠经治疗后抗转移实验结果。简而言之，该研究设计的GCT@CM NPs纳米平台具有多个优势：1）构建的NPs联合CM显著提高了1G3-Cu和Toy的生物利用度并降低了它们的副作用，使1G3-Cu和Toy在TME中响应性释放，从而通过线粒体和内质网应激两个途径诱导肿瘤细胞凋亡；2）Toy介导的内质网应激放大可以与1G3-Cu诱导的线粒体功能障碍协同作用，增强ICD效应，熟化DCs并招募免疫细胞进入TME；3）GCT@CM NPs与Anti-PD-L1联合使用，可产生长期免疫应答，抑制肿瘤的复发和转移。本研究制备的GCT@CM NPs为整合不同的治疗靶点以实现化疗增强的免疫治疗提供了新的思路。以上研究成果以“Biomimetic Polymeric Nanoparticle-Mediated Chemotherapy Potentiates Enhanced Tumor Immunotherapy via Amplification of Endoplasmic Reticulum Stress and Mitochondrial Dysfunction”为题，在线发表于国际著名期刊Advanced Materials (DOI: 10.1002/adma.202206861)。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授与沈明武教授为共同通讯作者，博士生郭云琦和范钰为共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目、上海市科委政府间国际合作项目及中央高校研究生创新基金等项目的资助。
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https://doi.org/10.1002/adma.202206861
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