手把手教你shRNA敲降基因（附Snapgene安装包+操作视频），史上最完整步骤：

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一、今日推送

研究一个基因，我们一般都是利用shRNA的方法将该基因敲降，随后看有没有表型，并且在发表文章的时候，使用的shRNA序列是需要提供的：

所以，小编今天给大家讲述shRNA的原理及设计方法（下附万能模板+实操+Snapgene安装包+Snapgene操作视频）。讲述shRNA之前，先给大家回顾siRNA。

一、siRNA的RNA干扰通路：

siRNA是一种小的双链RNA分子（21-25 nt），一般是在体内由人工合成。siRNA进入细胞质后（下图右侧），可以直接装载到RISC上，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端12 nt的位置切割mRNA、降解或处理小体（P-bodies）的翻译抑制。或是进入Dicer酶介导的干扰过程，最后也是对mRNA进行切割降解或处理小体（P-bodies）的翻译抑制（注：siRNA是转录后水平）：

二、shRNA的原理:

shRNA是可以克隆至表达载体并表达双链siRNA的RNA分子，其结构如下，具有发夹结构+茎区成对的反义和正义链（各21bp）+未配对的成环核苷酸：

shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成（体外转染到细胞质后，会进入细胞核），初级转录本（Pri-shRNA）由Drosha/DGCR8复合物处理形成pre-shRNA。Pre-shRNA被运输到细胞质中，装载到Dicer/TRBP/PACT复合物上，随后被进一步加工成成熟的shRNA。成熟shRNA与含有RISC的Argonaute蛋白结合，介导mRNA的切割和降解或处理小体（P-bodies）的翻译抑制，行使RNA干扰功能。

明白了shRNA的结构和作用原理之后，那我们如何设计shRNA序列并将其构建在载体上转染到细胞内呢？原理如下图：

如上图，我们一般是将shRNA序列连接到PLKO.1-puro载体的U6启动子区域后面【根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II（如：CMV，EF1A等）或者RNA聚合酶III（如：U6，H1）催化转录。II一般驱动蛋白合成，III一般驱动RNA合成，所以我们一般构建过表达的时候都是用带有CMV启动子的载体】。

我们知道，pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点是AgeI与EcoRI：

所以我们的shRNA序列应该是：

就能接进去：

最后，我们要确定的就是能够靶向目的基因的Sense序列，然后把这个序列补全就是我们的shRNA了。原理如下图：

三、shRNA的设计

小面，小编以人TP53为例接着教大家设计shRNA，打开生物医学之家（www.swyxzj.com）进入sigma设计：

我们就可以看到很多都是已经验证了的，非常方便，敲降效率达到了92%：

这一段序列就好比我们的sense序列，那我们就可以填补进去了：

随后我们获取该序列的反向互补序列：

填补antisense进去：

其互补链也是一样继续互补（不反向）,最后变为下图这样，shRNA就设计好啦：

如上，我们只要知道靶向目的基因的Sense序列（也就是靶向序列），然后再反向互补一下，我们的shRNA就搞定了。就是这么简单。

最后发给公司，要公司合成这两条Oligo就行了。后期再退火形成双链即可与载体连接了。

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四、PLKO.1-puro空载序列的获取：

从生物医学之家（www.swyxzj.com）进入Addgene：

输入载体名称：

找到并点击进入：

将序列下载下来：

用Snapgene（点击下载安装包，或者关注公众号号医学学霸帮，回复关键词“SG”下载）打开：

选择我们要切开的两个酶：

就非常清楚我们要切掉哪一段：

四、PLKO.1-puro-TP53-shRNA质粒图谱：

也就是我们前面给大家展示的，将这个图谱保存起来，日后好查看：

首先，我们得记住AgeI的酶切位点是accggt：

EcoRI的酶切位点是gaattc：

那在Snapgene里面，要在一段序列中插入另一段序列，需要这两段序列具有共同的粘性末端，如下，然后才会通过碰撞后插入进去：

那我们要将shRNA插入到PLKO.1的空载中，就需要shRNA序列中头端带有AgeI的酶切位点序列accggt和尾巴EcoRI的酶切位点序列gaattc。

那我们看shRNA如下，开头是CCGGC，并不是ACCGGT，所以我们要将CCGGC变为ACCGGT(注意小写，后面方便我们删除加的碱基)：

并且在尾巴我们我们只看到一个G，所以我们要将G变为Gaattc:

随后将这一段复制起来，粘贴到snapgene中：

这个时候我们就可以看到shRNA带有两个位点了，并另存为TP53shRNA需要插入的序列。就可以与PLKO.1发生碰撞连接了：

如下操作连接。选中PLKO.1的两个位点，随后点击插入片段：

跳出页面，右边的意思是告诉我们将在这两个位点间插入：

随后双击片段这两个字，将需要插入的片段拖进来：

跳转出如下页面：

随后我们再告诉它我们通过AgeI和EcoRI这两个酶切位点去碰撞，随后点击克隆：

就组装好了：

我们再次点击这两个位点，点击序列：

这个时候我们要记住，发现shRNA进去了，但是多了一个t：

我们将鼠标放在这里选中t，按一下电脑的删除键就行：

这样就是我们的shRNA连接到载体上啦。我们再标记好：

为了以防万一错误，我们复制一下shRNA：

然后回到组装好的质粒上图谱上，按住ctrl+F，再Ctrl+V粘贴，回车，搜索一下是否存在，存在的话就会被选中：

好，确实没错，再将这个图谱保存起来就OK了。好了，后面再教大家有了引物之后退火成双链，与载体连接等等的实验操作了。

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