最近，美国食品和药物管理局（FDA）召开细胞、组织和基因治疗咨询委员会会议，讨论Vertex Pharmaceuticals 与CRISPR Therapeutics 合作开发的治疗镰状细胞病（SCD）的基因治疗药物：Exagamglogene autotemcel（Exa-cel）。经过长达8个小时针对药物的临床结果、安全性担忧等问题的数据展示、问询，顾问委员会深度讨论了Exa‑cel基因编辑脱靶的风险。会后FDA并未请顾问委员会就Exa-cel的上市审批发起投票，而FDA将会在12 月 8 日之前决定是否批准Exa-cel的上市申请。作为有可能成功上市的第一款CRISPR基因治疗药物，这场讨论也是备受瞩目，小编也及时来帮大家整理一下昨天晚上会议的内容。一．镰状细胞病（Sickle Cell Disease，SCD）镰状细胞病（SCD）是全世界最常见的遗传性血红蛋白病，每年的新出生的患儿数量高达300000人。正常的成人血红蛋白 (Haemoglobin Hb) 是一个结构复杂的蛋白，它由两个 α-珠蛋白亚基和两个 β-珠蛋白亚基形成。血红蛋白的三级结构会形成结合血红素的口袋，每个血红素分子都含有一个二价铁 (Fe2+) 分子。然后四个珠蛋白亚基相结合形成 Hb 的最终四级结构，即四聚体。β-珠蛋白亚基由HBB 基因编码，当病患的HBB基因第六位氨基酸的密码子携带有A-T突变时（HBB第六位氨基酸密码子CTC；HBBβ S镰型突变第六位氨基酸密码子CAC），原有的谷氨酰胺 (Glu)会突变成缬氨酸 (Val)。
血红蛋白是红细胞内主要的携氧分子。镰状血红蛋白（由两个 α-珠蛋白亚基 和两个 β S突变型-珠蛋白亚基组成）因为疏水性缬氨酸残基突变而具有粘附性，所以当它脱氧时，会在红细胞中沉淀形成刚性的半固体聚合物，进而导致相应红细胞的镰状化。镰状化会损害红细胞，导致慢性溶血（溶血是指红细胞破裂，血红蛋白逸出。红细胞通常有110至120天的寿命，死去的红细胞会被送往肝脏和脾脏分解。然而，镰状细胞病会导致红血球在肝和脾以外的地方被异常分解，令血液中红细胞含量减少，血红蛋白漏出，溶血使红细胞的寿命缩短至约 10-20 天）和聚集，从而导致血管闭塞（血管闭塞会导致组织缺血，以致缺血引起的组织死亡、梗塞）。病患身体几乎每个器官都会受到影响。急性并发症包括急性胸部综合征、脾隔离和中风。从长期来看，镰状细胞病会影响身体的所有器官，并可能导致大脑、心脏、肺和肾脏（以及其他部位）的终末器官损伤。
镰状细胞病是一种复杂的多系统疾病，但随着医疗保健、早期诊断和综合治疗方面的进步，高收入国家镰状细胞病患者的预期寿命大幅提高，几乎所有患者都能存活到 18 岁以上。然而，即使有最好的治疗与护理，病患的预期寿命仍会缩短约30年。就目前来说，镰状细胞病主要采用以下的治疗方法：羟基脲是一种核糖核苷酸还原酶抑制剂，它原本是化疗药物，用于治疗慢性粒细胞白血病、骨髓增生性疾病等适应症。但由于羟基脲的安全性和增加HbF表达等生理功能，该药物被大量使用于治疗镰状细胞病，可以显著降低患者血管闭塞的发生率、病患的住院率和死亡率。输血是治疗和预防镰状细胞病及其并发症的重要手段，这种疗法主要是通过输注健康人的血液或者健康人的红细胞，来降低镰状红细胞的比例，从而改善微血管的血流供应，降低内皮损伤和炎症损伤相关的风险。但随着持续输血，铁过载会不可避免地会发生，并可能导致心脏和肝脏的衰竭以及多种并发症（每输注1个单位的红细胞，将有约200 mg的铁进入受者体内。衰老的红细胞被脾脏、 肝脏等的网状内皮系统的单核巨噬细胞吞噬，释放出的血红素铁可被重复利用。成人每天维持机体生理活动需要铁20～25 mg， 多余的铁以铁蛋白和含铁血黄素形式贮存在单核-巨噬细胞系统。由于机体缺乏有效的排铁机制，反复的红细胞输注会导致体内铁量剧增，当机体铁量超过网状内皮系统存储能力及血浆铁蛋白结合能力时，血浆非转铁蛋白结合铁增加，进而易沉积在肝脏、心脏、垂体和胰腺等全身组织器官。游离的铁也可催化具有高度活性的羟自由基形成，导致膜功能的损伤和蛋白质变性， 引起组织细胞损伤和器官功能衰竭，最终造成肝脏、心脏、垂体前叶和胰腺等主要靶器官损害，严重威胁患者生存质量和生命安全）。因此病患还需要服用铁螯合剂来避免铁超负荷的情况发生。造血干细胞移植是目前唯一可以治愈镰状细胞病的方法，来自于健康供体的造血干细胞可以分化为含有正常血红蛋白的红细胞，而移植前期的清髓会大量降低HbS β 珠蛋白基因突变细胞的比例。但这种疗法由于缺乏合适的供体而受到严重的限制。三．基于CRISPR的基因编辑药物Exagamglogene autotemcel (Exa-cel)1.Exagamglogene autotemcel (Exa-cel)的治疗机理在人体中，有两个对于珠蛋白合成很重要的基因簇。α珠蛋白基因簇：位于16号染色体上。包含胚胎珠蛋白基因ζ和两个拷贝的α珠蛋白基因（α-1和α-2）。另一个是β珠蛋白基因簇：位于11号染色体上。包含胚胎珠蛋白基因ε、胎儿珠蛋白基因γ以及成人β和δ珠蛋白基因。其中γ-珠蛋白在胎儿发育的妊娠晚期表达，并与 α-珠蛋白亚基配对形成胎儿血红蛋白 (HbF)。HbF的表达水平会在胎儿孕育6-9个月时下降，下降一直持续到出生后的6个月，直至表达停止。与此同时，成人血红蛋白（α -珠蛋白+β-珠蛋白）的表达逐渐上升，进而取代HbF在体内的功能。
患有 SCD 的新生儿和婴儿，由于突变仅发生在β-珠蛋白亚基上，因此HbF还是能够发挥正常功能的。只要 HbF 的表达保持在高水平，就不会出现SCD的症状，这也是为什么SCD患儿的症状多在出生后一年内HbF 被镰状珠蛋白取代时才出现。BCL11A是一种含锌指结构的转录因子，可抑制红细胞中的 γ 珠蛋白表达。BCL11A基因发生突变的患者，其HbF 在成年期能够持续高水平表达，因此显著减轻了 SCD 病症的严重程度。这一遗传学上的现象，为Exagamglogene autotemcel (Exa-cel)的开发，提供了理论的基础。
Exagamglogene autotemcel (exa‑cel) 是一种一次性单剂量基因/细胞治疗药物，由经过 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑的自体CD34+ 人类造血干细胞和祖细胞 (hHSPC) 组成，用于治疗 12 岁及以上患者的严重镰状细胞病（SCD）。Exa‑cel中的细胞，会经过电穿孔将Cas9蛋白与sgRNA递送到其内。CRISPR复合体会结合在位于BCL11A基因内含子上的红细胞特异性增强子中--转录因子GATA1的结合区域，在引入DSB后，利用NHEJ产生突变，破坏该增强子，降低BCL11A在红细胞中的转录水平，从而特异性提高HbF在红细胞中的表达，缓解SCD症状。
针对CD34+HSPC基因组的编辑过程仅在离体状态中短暂进行，因此当Exa‑cel回输给患者时，细胞中不存在残留的基因编辑活性。此外，CRISPR系统编辑的位点也有着细致的考量：1. BCL11A红细胞特异性增强子区域天然就有发生突变的现象，突变携带者HbF表达水平提高、SCD症状减轻，且没有其他的临床表现，是一个安全的编辑位点；2. 编辑的位点位于非编码的内含子上，且距离codingsequence有25kb以上的距离，因此对BCL11A蛋白本身的功能不会造成影响；3. 编辑的区域为红细胞特异性增强子，因此仅仅会影响BCL11A在红细胞中的表达，对其他的造血细胞例如B细胞HSC等则没有影响；4. sgRNA的靶序列在基因组中是唯一的，从而实现在设计角度的高特异性。
上一个备受瞩目的基因治疗产品SRP-9001在咨询委员会过会时，其备受争议的点是在不同年龄分组中，有着截然不同的临床结果。而在目前开展的3个临床试验中，无论是传统审批的主要终点还是加速审批的替代终点，Exa‑cel都有着不错的表现，在药效上来说，还是收到了专家的认可。Exa‑cel 对 SCD 疗效的证据来自于关键的 1/2/3 期临床研究CLIMB 121 和长期随访研究 CLIMB 131。
CLIMB 121：CLIMB 121是一项多国、单臂、临床1/2/3 期研究，旨在评估Exa‑cel对 12 至 35 岁患有严重 SCD 且反复出现 VOC（Vaso-occlusive crises 血管闭塞危象）的患者进行单剂量治疗的安全性和有效性，该项研究一共入组了45 名受试者。CLIMB 121要分四个阶段来进行，第一阶段为筛选阶段，入组患者至少提前8周进行红细胞输注或者输血，以维持HbS < 30% 且减少在动员、细胞分离、回输阶段的SCD并发症或VOC；第二阶段包括HSPC动员、自体 CD34+HSPC采集、Exa‑cel 制造和制剂。在第二阶段，患者需服用Plerixafor将骨髓CD34+ HSPC 动员到外周血中，再通过单采术收集 CD34+ HSPC。在第三阶段，患者需要服用白消安Busulfan来进行清髓，去除含有β-珠蛋白突变的造血干细胞。然后在第四阶段，患者会接受Exa‑cel的回输和长达两年的随访。
CLIMB 121主要疗效终点是达到 VF12（VF12 是指在CLIMB 121中Exa‑cel 输注后 12 个月内没有发生sVOC-SCD Painful vaso-occlusive crisis）的受试者比例。关键次要疗效终点是在Exa‑cel 输注后12个月内（HF12），受试者中不再因 sVOC 住院的受试者在总给药人数中的占比。而三个次要疗效终点，则包括达到VF12的患者中未出现sVOC的持续时间、未达到VF12患者中sVOC年化率的降低水平，以及HbF≥20%的受试者比例。
从结果来看，在可评估疗效的 30 名受试者中，有29 名 (96.7%) 达到了 VF12 的主要疗效终点。在达到 VF12 的 29 名受试者中，28 名受试者的不因 sVOC 住院平均持续时间为22.3 (SD 7.2) 个月，最长为 45.5 个月。所有 30 名 (100%) 可评估受试者均达到了 HF12。
临床疗效终点同样也得到药效学终点的支持。在Exa‑cel 输注后，患者体内观察到高比例的HbF 阳性细胞 (≥ 90%)，且F 细胞的比例与HbF 的表达保持持续增长。在 4 年随访期间，F 细胞比例的平均值从第 6 个月起≥ 93%，从第 12 个月起≥ 96%。与HbF 表达的增加相一致，患者自Exa‑cel输注后 12 个月开始不再需要接受任何因 SCD 相关指征引起的红细胞输注治疗，红细胞输注量较基线减少了 100%。而在基线时，患者接受的红细胞输注量每年平均为 8.4 (14.9) 单位。此外，受试者的胎儿血红蛋白和总血红蛋白表达量也有所增加，在第 3 个月时总Hb的平均水平为 12.0 (1.3) g/dL，而在第 6 个月到数据分析时，总Hb的平均水平依旧≥11.1 g/dL 。
另外，骨髓和外周血中BCL11A基因的编辑是稳定的。在 SCD 受试者中，从第 2 个月到第 42 个月，骨髓 CD34+ 细胞的基因平均编辑率≥80%，外周血中CD34+细胞的基因编辑率≥70%。在第 12 个月和第 24 个月时，骨髓细胞基因组编辑比例最低的患者也达到了 VF12 的主要终点。稳定、持久的基因编辑与稳定、持久的 HbF 表达是相一致的，这表明消除病患 VOC 这一临床收益也将是稳定、持久的。
CLIMB 131：CLIMB 131是一项正在进行的、全球性、多中心、开放标签的临床研究，它旨在评估在 CLIMB-111、CLIMB-121、CLIMB-141、CLIMB-151 中接受 Exa-cel 治疗的患者的安全性和有效性或 CLIMB-161。这项研究合并了多个适应症的接受Exa-cel 治疗的患者，并要进行为期 15 年的跟踪研究。3.Exa-cel的安全性----大家真正的争议点与前期FDA通过的Sarepta Therapeutics DMD 320万美金的基因疗法Elevidys不同，Exa-cel在临床表现上，还是说服了与会的委员们。因此大家对Exa-cel真正的争议点，还是在安全性上，这也是FDA对CRISPR药物最大的担忧点。Exa-cel 的申请资料中，提供了脱靶评估的详细内容，其中包括基于不同算法的sgRNA-人类基因组同源性预测、基于GUIDE-seq实验的分析结果，以及基于8名健康人、3 名SCD名患者、3名TDT患者供体细胞超高深度的测序结果。
在基于不同算法的sgRNA-人类基因组同源性预测中，研究者比对了与sgRNA最多有5个错配mismatch或最多2个错配mismatch+1个bulge的序列。在PAM序列上，同源性预测了与Cas9标准PAM (NGG) 以及非标准 PAM（NAG、NGA、NAA、NCG、NGC、NTG、NGT）相匹配的全部位点。最终研究者预测到了5007个有可能脱靶的同源区域、857 个 GUIDE‑Seq 区域、171个 candidate sites和50 个additional sites。为了验证Exa-cel实际编辑中是否在该区域脱靶，研究者使用Exa-cel的CRISPR系统编辑了4名健康捐赠者的 CD34+ HSPC，并对这些区域进行了深度测序（中位覆盖度>2500X），但均未发现脱靶情况。在另外的分析中，Exa-cel还进行了两组实验，其中其中一组使用了4个健康供体来源的 CD34+ HSPC ，另一组使用了3个SCD 供体来源的 CD34+ HSPC以及3个TDT 供体来源的 CD34+ HSPC。结果与第一项研究相同，研究者并未在健康供体、患者供体样本的任何位点观察到脱靶编辑现象的发生。
但FDA提出异议，他们认为为了进行充分的安全性评估，脱靶分析需要考虑患者人群中人类基因的突变或异质性。因此所用比对的数据库，需要能够充分代表患者群体的基因组序列突变情况。Exa-cel用于比对的数据库，来源于千人基因组计划，包含2,504 个个体（并且数据库2,504 个个体中，仅有661人是来自SCD高风险的非裔人群，仅有61人来自美国且来源集中在美国南部的一个州。）。因此，FDA认为目前尚不明确有限的基因组测序数据是否足以代表患者群体中可能存在的突变。测序数据样本数上的不足可能会导致Exa-cel在真实患者中产生脱靶（该突变未在数据库中体现）。
此外，FDA提出的异议还在于，SCD是可以诱导炎症、氧化应激反应的，而这种反应会影响患者CD34+ HSPC 的染色体修饰，并且SCD还会影响HSPC的功能以及谱系。因此，来源于健康供体的CD34+ HSPC的分析结果并不一定能够充分代表在患者群体中可能发生的脱靶情况。其次，该研究仅使用了来自4个非裔美国人的供体样本（其中3个来自于SCD患者，1个来自于健康供体），因此样本总数有限，无法对可能的出现的脱靶情况做出充分的评估。当地时间周二上午 9 点至下午 5 点，由基因编辑、干细胞生物学、生物统计学和镰状细胞病领域的专家、患者、行业代表组成的咨询委员会就Exa-cel基因编辑脱靶的风险展开了讨论，从讨论的结果上看，与会专家主要呈乐观的态度。与上次备受争议的SRP-9001不同，Exa-cel在药效上十分令人满意，几项临床研究都达到了主要终点，大家考察的重点因此也主要是落在安全性上。然而没有一个药物是完全安全的，且前期的临床研究中体现的安全性，也并不能代表真实世界中的状况。对于CRISPR技术的药物开发来讲，目前大家能够做到的科学探究，也只有这么多。就像会上UMass Chan的Scot Wolfe说的 "It's really exciting to see how many patients have been treated and how positive the results have been.We want to be careful to not let the perfect be the enemy of the good." 在上市前有限的研究里，Exa-cel所体现的临床收益是远大于临床风险的，因此之后FDA大概率是会批准Exa-cel上市的申请（何况Zynteglo用lenti都过了）。虽然大家都认为CRISPR是一个好的科研技术而不是一个好的药物，但是Exa-cel却给大家展示了当一个技术找到合适应用场景时，所能发挥的强大作用。参考资料：
https://www.youtube.com/live/M90IjjxOdQg
https://www.fda.gov/advisory-committees/advisory-committee-calendar/cellular-tissue-and-gene-therapies-advisory-committee-october-31-2023-meeting-announcement-10312023
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2023.1141020/full
https://medcell.org/tbl/microangiopathy_sickle_cell/reading.php
https://sickle-cell.com/causes
https://www.nature.com/articles/nrdp201810
https://www.nature.com/articles/nrdp201810
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6645400/
https://www.nhlbi.nih.gov/health/sickle-cell-disease/treatment
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4254544/