治疗性双特异性抗体的开发与生产
本文节选自“Development and Manufacture of Therapeutic Bispecific Antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
为了满足对新型和改进药品的持续需求，生物制药行业致力于创造具有新功能的分子。双特异性抗体(bsAb) 可以同时针对两个不同的靶点，说明了这项任务所需的科学独创性。这些复杂分子的基本概念证明建立于1960 年代，并且在 1980 年代中期报道了它们在效应细胞重定向中的应用，但事实证明，其生产仍极具挑战性。
在生产数量足以用于临床开发的 bsAb之前，需要许多大大小小的技术进步。这些进步中的一个关键是单链可变片段 (scFv) 的发明和方法的创建，其可以使抗体蛋白链形成两个不同的靶点结合位点，而不是像天然产生的抗体那样形成两个相同的靶点结合位点。由两个不同的scFv 组成的 T 细胞重定向 bsAb 于1990 年代中期产生。用于重链异源二聚化的抗体结构域工程“knobs-into-holes”（杵臼结构）方法大约在同一时间首次亮相。1998年，研究人员用两条不同的重链和两条相同的轻链构建了双特异性。在这些早期进展的基础上，抗体工程师已经设计了100 多种 bsAb。
迄今为止，已有四种 bsAb 获得了上市许可。与 scFv 和 T细胞重定向相关的早期科学发现为开发前两种获批产品Removab (catumaxomab) 和Blincyto (blinatumomab) 奠定了基础。Catumaxomab 于 2009 年首次在欧洲获批用于治疗恶性腹水，但随后因商业原因被撤回。相比之下，2014 年批准的 blinatumomab（包含靶向 T细胞上 CD19 和 CD3 的串联scFv）引发了对 T 细胞重定向方法的极大兴趣。最近获批的 bsAb - Hemlibra（emicizumab）和Rybrevant（amivantamab）- 依赖于不同的设计。前者的双特异性来源于常见的轻链方法；而后者是使用Genmab 专有的 DuoBody 技术构建的。通过这种方法，两种抗体（各自具有不同的特异性）分别表达，然后在有利于形成双特异性分子的条件下纯化并混合在一起。
临床管线
自 2000 年以来，由商业公司开发的 200 多种bsAb 已在临床研究中进行了评估，尽管它们中的大多数只是最近才进入临床研究，但考虑到该行业早期在可用方法方面相对缺乏经验，这并不奇怪。BsAb 在 2000 年代进入临床研究的速度仅为每年大约 1 个，到 2010 年代前五年增加到了每年大约 6个。然而，从那时起，构建和生产方法的成功和扩展使管线的显著增长。在过去的六年中，平均每年有27 种 bsAb 进入临床研究。由于这种增长，商业临床管线现在包括约 160 种基于 bsAb 的疗法。大多数处于早期开发阶段，只有大约十几个处于后期临床研究阶段。
bsAb 的商业临床管道主要集中在肿瘤治疗上。在临床研究中的约160 种双特异性药物中，约 90% 正在对一种或多种肿瘤进行评估。两种方法占主导地位：T 细胞衔接和免疫检查点调节。它们分别占目前临床试验中的抗肿瘤双特异性药物的约 47% 和约 28%。T细胞衔接双特异性药物（如 blinatumomab）靶向 T 细胞上的肿瘤相关抗原(TAA) 和 CD3，从而使细胞毒性 T 细胞靠近肿瘤细胞。在靶向CD3 的双特异性抗体中，两个最常见的 TAA 靶标是 B 细胞成熟抗原(BCMA) 和 CD20。在双特异性免疫检查点调节剂中，常见的靶点包括 PD-1 和 PD-L1、CTLA-4、4-1BB、OX40、TIM3、TIGIT、LAG-3 和CD47。
生产要求
开发合适的生物生产工艺是新 bsAb 候选药物商业化的核心要素。为其双特异性候选产品定义工艺的公司总是希望使用能够获得高滴度的表达系统和上游工艺，以及在提供所需纯度的同时最大限度地提高产量的高效纯化工艺，以最大限度地提高生产力。此类工艺必须稳健并符合与其它生物药相同的监管要求。
bsAb的开发商注意到，这些分子的生产规模通常与标准单克隆抗体(MAb) 的生产规模相匹配。我们发现，bsAb 开发商通常更喜欢以比常规 MAb 生产更小的规模生产早期临床材料，因为更高的效力可以提供更低的剂量要求。尽管如此，公司可以将其工艺放大到大规模细胞培养生产设施，以进行后期临床研究和商业化。下一代抗体生产工艺的可放大性与标准MAb 一样重要。
对于拥有包含多个双特异性候选产品的管线的公司来说，平台化的生产工艺通常是非常理想的选择。这种方法能够实现快速的早期工艺开发；提供时间和成本效率；减少原材料和耗材的交货时间；促进工艺转移、分析开发和监管提交。当候选产品结构相似时，通常采用平台方法，但它也可以应用于不同的分子。例如，尽管候选产品具有不同的结构和形式，但百时美施贵宝(BMS) 为 bsAb 采用了一个平台。
表达系统
单链可变片段已在细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞（基于杆状病毒）、植物细胞和无细胞表达系统中表达。大肠杆菌是表达scFv 蛋白的常见选择，因为细菌在廉价培养基上生长迅速，并且可以大量生产蛋白质。然而，表达的scFv 分子可能被错误折叠或形成包涵体，需要额外的下游工艺步骤来复溶和重折叠蛋白质。
使用哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞，生产 scFv 可以克服这些问题，因为真核细胞具有先进的内部蛋白质折叠过程以及进行复杂翻译后修饰的能力。通常用于MAb 和许多其它蛋白质的生物生产，高度可放大的CHO 细胞培养物可以稳定地表达蛋白质并以足够高的滴度与原核表达系统竞争。然而，哺乳动物细胞系的生长速度比原核细胞慢，这使得生产需要更长的时间。
出于同样的原因，IgG 样 bsAb 主要在哺乳动物细胞系中表达。然而，在确保将抗体片段正确组装成IgG 样双特异性抗体方面出现了生产挑战。四种不同的多肽链可以以16 种可能的方式组合，其中只有两种（约表达的12.5%）具有所需的不对称异源二聚体结构，其余的（约87.5%）成为杂质。
这个问题在用于生产首批 bsAb 的四源杂交瘤技术中尤为明显。四源杂交瘤由两种表达单特异性二价抗体的杂交瘤细胞系融合而成。所得细胞从两个亲本系中产生重链和轻链。这些分子随机组装，因此它们中只有一小部分形成所需的bsAb。其它的变成与产品相关的异构体，包括游离的重链、轻链、同源二聚体、半分子和错配的抗体，这些都是需要通过复杂的纯化工艺去除的杂质。所需抗体结构的低表达水平加上繁琐的纯化方案最终导致整体工艺生产力较低。
蛋白质/细胞工程提高可制造性
为了应对这一挑战，蛋白质工程师开发了许多不同的策略来设计具有改进的可制造性特征的bsAb 分子。Fc 异源二聚化技术确保通过互补重链的组合产生不对称分子，这大大减少了组合可能性的数量。杵臼结构技术实现了Fc 异源二聚化，据报道提高了抗体稳定性，使蛋白质对Protein A 层析纯化过程中波动的 pH 条件具有更高的耐受性。CrossMab 技术和常见的轻链方法是蛋白质工程方法，可通过确保轻链和重链正确配对进一步减少产生的结构组合数量。
这些方法使生物制药公司能够使用与用于生产MAb 的那些方案非常相似的生产方案进行双特异性候选产品的生产。例如，Merus使用 DG44 CHO 细胞系生产了 2,000 L 规模的双特异性人源化IgG1 抗体（zenocutuzomab），细胞培养过程在生产生物反应器中耗时 14 天。使用一种熟悉的 MAb 下游工艺来纯化药物底物，其中包括Protein A 捕获步骤，然后是低 pH 保持病毒灭活、流穿阴离子交换层析以及最终的阳离子交换层析步骤，以去除少量残留的同源二聚体和半IgG 污染物。洗脱液通过 20-nm 除病毒过滤器过滤，然后将溶液浓缩并将药物底物制剂成 20 g/L。Merus 工艺提供了1.0–1.5 g/L 的生物反应器滴度和 60–75% 的下游产率。尽管按照 MAb 标准，这种工艺性能并不是特别高，但对于许多处于早期开发阶段的此类产品来说，它被认为是可以接受的。
尽管候选药物设计的改进导致了强制配对，但生成能够产生高浓度异源二聚体而不会同时增加与产品相关的杂质的细胞系仍然是开发经济上可行的工艺、以产生安全有效的产品的重要目标。
一个细胞系工程师小组确定了一种产生表达包含三个多肽链的bsAb 的细胞系的工艺。为了提高正确组装蛋白质的可能性，科学家们将三个基因引入到不同的载体中，使开发人员能够优化所产生的不同质粒的比例。用细胞分泌试验分析转染的池，以确定其中哪些含有高比例的高生产者。该团队使用具有十二烷基硫酸钠(CE-SDS) 的毛细管电泳来确定含有最高比例的所需双特异性异源二聚体形式的池。从具有最优化质粒比率的池中创建克隆，并在微型生物反应器中生长，以评估生长性能、生产力和异源二聚体纯度。最终，该团队选择了一个克隆，该克隆表达的异源二聚体纯度以CE-SDS分析为 97%，以尺寸排阻高效液相色谱 (SEC-HPLC)分析为98%，且聚体 <2%。所得细胞系以约 5 g/L 表达bsAb，并证明其稳定超过 60 代。
并非所有的开发小组都采用将编码 bsAb 的每个基因整合到单独的载体中的方法。Eli Lilly 的一个团队将两条重链和两条轻链基因整合到一个单质粒四联体载体中，该载体提供与多质粒系统相当的滴度，同时促进稳定克隆的产生。
生产和工艺
上游：由于细胞培养基的成分已被证明会影响产品质量，因此应考虑将培养基设计作为控制细胞培养收获中部分产物、聚体和产物异构体水平的一种手段。Amgen的科学家已经表明，细胞培养温度可以调节 CHO 细胞系中的半抗体和聚体形成。该团队通过采用双相培养工艺减少了产物相关杂质的形成，其生长期为36 °C，随后是一个冷却阶段，通过提高产物质量，来提高下游工艺的产量。
下游：BMS 在其 bsAb 平台上使用标准的三级过滤工艺来收获细胞培养物。该工艺包括Protein A 亲和捕获步骤，但该团队进行了额外的开发工作，以优化上样载量并最大化步骤收率。洗脱缓冲液筛选有助于优化产量并最大限度地减少聚集。在离子交换和混合模式层析这两个进一步的精纯步骤之后，产物相关杂质被有效去除。尽管一个或两个纯化步骤的步骤收率低于MAb 的预期，但该平台允许纯化三种不同的bsAb，以满足临床试验的产品质量监管要求。
由于单克隆抗体和双特异性抗体之间的基本结构相似，目前许多双特异性抗体的纯化方法都是基于常规MAb 的既定纯化工艺。通常使用亲和、离子、体积、疏水性和混合层析模式，同时应用其它策略来克服bsAb 带来的独特挑战，包括聚体、片段形成和错误配对的产物。
例如，Regeneron 的研究人员使用差异Protein A 层析法去除同源二聚重链错配分子，其将点突变引入一条重链的Fc 区以防止Protein A 结合。因此，具有突变的同源二聚体在上样过程中流穿捕获柱，而完全的 bsAb 可以通过这种方式分离。
尽管Protein A 层析仍可能是捕获 bsAb 的主要手段，但TeneoBio 及其合作伙伴已报告用另一种基于固定在琼脂糖上的美洲驼VHH“纳米抗体”片段的亲和填料替代传统填料，以用于双特异性 CD3-TAA 候选产品的纯化。配基与 IgG 重链的CH1 结构域特异性结合。这使团队能够减少具有完整Fc 结构域的产品异构体的共纯化，并在温和条件下洗脱产品，从而最大限度地减少活性和非活性异构体的聚集。
除了最初的捕获步骤之外，另一组纯化开发科学家采用了混合模式精纯步骤，以促进去除由对称bsAb 的不完全链配对引起的副产物。这是通过以弱分区模式操作层析柱来实现的，该模式可提供高通量、良好的收率以及有效的副产物去除。
推动抗体技术向前发展
产生具有两种或多种特异性的抗体是治疗性抗体开发中最具创新性的领域之一。它具有巨大的潜力，可用于为目前有未满足需求的患者创造新的治疗方法。双特异性抗体的开发也刺激了从表达到上游工艺和候选物纯化的生物工艺技术的创新。在可能的情况下，工艺开发科学家和工程师正在借鉴成熟MAb 平台中磨练出来的技术，并将其应用于bsAb 生产。然而，双特异性的独特性质使得为它们开发生物生产策略仍然是一种新兴的艺术形式。为这类产品创造高生产量和高收率的工艺还有很多工作要做，随着未来bsAb 变得更加复杂和精细，挑战可能还会进一步增加。
原文：J.Reichert, N.Hutchinson, Development and Manufacture of Therapeutic Bispecific Antibodies. BioProcess International, 2022.
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