自体CAR-T细胞产品开发的考量：载体供应 & 产品表征
本文节选自来自Autolus等的研究人员发表的文章“Considerations for the development of autologous CAR-T cell products”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“自体CAR-T细胞产品开发的考量：理解 & 控制起始材料”以及“自体CAR-T细胞产品开发的考量：生产平台”。
肿瘤患者的成功临床结果正在推动大量投资流入目前正在临床开发中的新型创新 CAR-T 细胞产品。尽管迄今为止初步获批的药物数量相对较少，但目前正在进行中的 CAR-T 细胞疗法管线将显著扩大这些疗法的影响，并释放它们真正的、前所未有的潜力。然而，这些个性化疗法对生产和商业规模放大/扩展提出了独特的挑战。从我们的角度来看，我们将在这里介绍一些关键挑战，以建立一个有效的临床生产及更进一步的工艺流程，包括患者起始物料（细胞单采）、用于自体治疗的灵活封闭生产平台的日益商业化、分析方法开发、关键原材料和试剂的适用性以及载体供应。
产品表征：聚焦于效力分析
放行检测、稳定性检测和可比性中最具挑战性的分析是载体和 DP 的效力分析，其需经过适合阶段的验证，并被执行，以证明载体和 DP 在从工艺开发到商业化的整个过程中始终符合放行的标准。可以开发、验证一种分析方法或分析方法的组合，并将其用作生物活性的替代测量，以显示与效力相关的生物活性的相关性。在 CAR-T 细胞免疫疗法的背景下，其被设计为代表 DP 作用机制 (MoA)，其中通常评估两种生物活性：检测递送到自体 T 细胞的基因以及此类基因修饰的生物学效应（例如，特异性杀伤目标肿瘤细胞、释放细胞因子）。所有开发商面临的挑战是早期积累的 DP 信息量，以及对 DP生物活性本身的理解的深度。此外，这些检测如何真正代表疗效并最终在患者中持续存在。效力分析最初设计为基于细胞的（生物）分析。其必须经过深思熟虑，尽可能保持简单，适当选择细胞系，分析开发策略，供应链以及关键试剂的预测。效力分析在生物可变性、参考材料的可用性和操作员培训方面提出了重大挑战，因需保持其在控制之下。因此，建议这些检测策略的开发应尽早开始，最好从适应临床前检测工作开始。成功验证的效力分析将减少大量 CMC 问题，随着生命周期的进展，对时间线、监管文件、分析开发和 QC 准备工作产生重大影响。
原材料适用性
生产过程中使用的原材料是对 DP CQA 产生影响的输入。原材料的定义不仅局限于在生产过程中与细胞直接接触的试剂和耗材。由于它们对 DP 的潜在影响，应使用工艺映射工具对原材料进行风险评估，并为每种原材料制定材料控制策略。因此，特定工艺的控制策略应首先确定在每个单元操作中使用哪些原材料输入，它们是如何引入的，以及每种材料在整个过程中直接接触 DP 的关键性（表 4）。
表 4. CAR-T 生产过程的每个单元操作期间与细胞产品接触的潜在辅助材料成分。
一旦确定了所有原材料输入，应根据相关的 DP CQA 定义每种（关键材料属性）的关键性。然后应评估归因于每种原材料的风险并确定预期的可变性，然后可以实施必要的控制，以确保生产的稳健性和 DP的安全性。风险类型的例子可能包括与无菌性、病毒污染、有毒物质、溶出物和析出物 (E&L) 以及供应链风险相关的风险。特别是，必须进行与由塑化 PVC 制成的输液管和储存装置（即血袋、转移袋、一次性套件）相关的析出性研究，以评估它们对以患者安全为重点的 DP制剂的影响。关于临床生产，所有原材料成分都需要获批用于人体，并应重点确保 cGMP 的适用性。重要的是要考虑耗材批次间的差异，并确保供应商在批次之间认证验收标准，以确保 DP 完整性。针对关键原材料确定替代供应商可以避免供应链问题，并降低生产中断风险。
载体供应：载体开发周期中为商业化做准备的考虑因素
CAR-T 疗法的早期成功使用了主要在学术实验室开发的载体工艺，其技术并非为工业化规模而设计，当载体供应的要求基于适应症、剂量和待治疗的患者数量而进行考量时，就会出现问题。成功的临床结果、试验活动的增加导致可用的、基于重组蛋白和单克隆抗体 (mAb) 生物工艺技术的非最佳再利用的病毒生产技术成了并不理想的选择。直到最近，供应商在新技术的开发方面仍落后于需求，从而较难满足全球市场为支持对CAR-T免疫疗法激增的兴趣而产生的对病毒载体需求的急剧增长。强调快速到达临床、以确认概念验证和确保进一步的资金，而不是耗时的工艺优化，这种行业现象进一步加剧了供应安全问题。只有在后期，从早期阶段到商业化供应的转变，规模放大/规模扩展问题才成为更加突出的焦点。
体外治疗的载体供应越来越多地集中在慢病毒载体上，因为它们能够转导分裂和非分裂细胞，并且非整合慢病毒载体开发的最新进展大大减少了插入性诱变，尽管γ-逆转录病毒仍然被某些研究团队使用。如果没有在一开始就进行战略规划，载体的短缺可能会成为一个主要问题。预测对于确定临床载体生产的启动很重要，例如选择使用瞬时转染的贴壁工艺，其中 cGMP 级质粒质量至关重要，或在 cGMP 下生成稳定细胞系 (SCL) 的主细胞库(MCB) 和工作细胞库 (WCB)。I 期临床试验的需求可以通过相对较小的生产来满足，这些生产将覆盖 10 至 30 名患者，并进行必要的放行检测，例如感染性病毒滴度、理化特性以及药典安全性检测。在应对载体后期阶段以及商业生产策略时，要考虑的主要方面是生产地点、瞬时转染或稳定细胞系、平台的可放大性和质粒质量。在初始阶段，内部平台、专用载体生产车间的需求以及有限的载体生产经验可能会推动公司与经验丰富的合同制造组织 (CMO) 合作，为公司管线中的部分或全部 T 细胞产品进行生产工作。与 CMO 合作的一些挑战是成本 – 这可能会很高，此外，技术转移和实施工作、分析方法开发和验证的时间线进展可能相对较慢，可能还需要与其它公司竞争生产排位。这种合作的积极部分是，CMO 的直接经验显著降低了与载体供应及其质量相关的风险，并为早期监管备案以及随后成功的产品许可申请提供了更好的机会。在某些情况下，公司可能希望对载体生产进行更好的内部控制，并做出决定以保留内部载体生产能力。当积累更多的工艺理解和产品知识，并将生产转移到内部时，仔细的载体CMC策略是基本要求，需要考虑到稳定细胞系及其细胞库的开发，或者如果决定采用瞬时工艺路径，则需要考虑质粒质量（GMP 细胞库和原材料）。
慢病毒载体主要使用瞬时转染产生。最初，磷酸钙被广泛用作转染试剂，但聚乙烯亚胺 (PEIpro®) 和 Lipofectamine® 现在被更广泛地用作实现可靠病毒载体生产以及高感染滴度产量的首选转染方法。瞬时转染比制备稳定细胞系更快，但由于批次之间的差异、质粒成本以及最终产品中潜在的质粒污染，因此对于大规模生产来说，可能不是最理想的选择。
在生产平台方面，慢病毒载体的生产经常使用需要血清的细胞系统，并使用 2D 平面表面技术（如分层细胞工厂、CellSTACK® 和 HYPERStack®）快速规模放大。最近的技术发展，如 Pall 公司的iCELLis 填充床一次性生物反应器，为贴壁细胞的扩增提供了一个高密度、封闭、可控的环境。iCELLis Nano 的表面积范围为0.53 至 4.0 m2，而iCELLis 500 的表面积范围为 66 至 500 m2，并且比细胞工厂所需的手动操作更少。与传统贴壁工艺相比，生物反应器中的载体生产可以更一致地控制工艺参数，例如 pH 和溶氧(DO2)。此外，生物反应器的使用还允许从用于工艺开发的 iCELLis Nano 放大到生产规模的iCELLis 500。与基于培养瓶的工艺相比，这显著减少了劳动力，后者只能规模扩展，而不是规模放大。关于剪切力，在聚酯载体中的固定可保护细胞免受鼓泡或来自叶轮的剪切，同时培养基向上循环通过固定床并在其以薄膜形式回落至容器时补充气体。固定床的高表面积与体积比允许采用较低的单位表面积接种密度，并且可以在细胞生长时通过灌流或再循环来增加培养基体积。现在已经在 iCELLis 生物反应器中进行了多种病毒载体的生产，包括γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体，并且通常很少或没有优化。
相比贴壁系统，用于慢病毒载体生产的无血清悬浮系统现在越来越受到青睐，并且可在 50 至 2000 L 的一次性 STR 生物反应器中进行规模放大。在最近发表的一篇文章中，研究人员描述了 Repligen 开发的切向流深层过滤 (TFDF™) 技术，用于收获在无血清悬浮系统中培养的慢病毒载体，并证明与标准批次收获工艺相比，载体生产力提高了两倍以上。此外，作者还证实了 TFDF™ 的潜在优势，即从单次瞬时转染工艺中，进行多次载体收获，从而提高整体工艺产量。最后一点是，工艺强化大大受益于稳定细胞系的开发，无需瞬时转染，从而简化了工艺，减少了手动操作以及需要监测的工艺相关杂质的数量。
平台的可放大性和表征明确的适当上、下游工艺步骤的结合，无论是贴壁（细胞工厂）还是悬浮（搅拌罐反应器），对于满足临床开发到商业化期间不断增长的需求至关重要（表 5）。渐进式可放大平台方法将确保一致的生产策略，并减少大量监管文件更新和研究，其被要求用于证明可比性以及在从开发到产品的整个生命周期中可保持载体质量，以确保患者安全和产品功效。
表5. 贴壁和悬浮培养系统的特性
总结
CAR-T 细胞疗法的生产是一项高度复杂的工作，需要基因疗法生产工艺（通常包括病毒载体）和细胞工艺 - 从收集 T 细胞、基因修饰以及扩增它们到DP制剂以递送给患者。这些复杂且多步骤的技术和物流充满了风险。在此过程中，开发商必须保持非常清晰的愿景和监督，以制定符合监管预期、当前良好生产规范 (cGMP) 和商业准备的适当策略。CAR-T 细胞开发、生产和检测中的挑战和机遇应该以更严格的方法解决，以扩大这些过继性细胞疗法的能力、精确度和持久性，不仅可以治疗已批准的血液系统肿瘤，还可以治疗晚期患者，后者可能无法提供足够的起始材料来制造高质量的免疫疗法。此外，作为开发商，我们需要采用可放大的系统，在应对患者起始材料的可变性方面更加灵活。
原文：A.Davidson, G.S.Toledo, K.Lilova, Considerations for the development of autologous CAR-T cell products. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(11), 1685–1696.
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