细胞培养生物工艺 - 走过的道路和前进的方向
本文节选自“Cell culture bioprocessing — the road taken and the path forward”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
哺乳动物细胞在生产复杂蛋白质方面具有巨大的生物合成潜力，这些蛋白质需要微生物细胞无法进行的翻译后修饰。三十年来，我们在利用这种合成潜力方面取得了极大的成功，并培育了一个非常庞大的生物制药行业。在本文中，我们将重点介绍细胞培养工艺技术方面的一些创新和革新，这些创新和革新促进了基于哺乳动物细胞的蛋白质治疗药物的持续成功，从工艺技术和产品质量管理，到优化的细胞系以及使用组学工具和系统方法（图1）。随着下一代细胞和基因治疗产品的出现，这些新的分析测试和系统方法将有助于塑造这些产品的制造过程，以提高生产力和产品质量。
图1. 细胞培养生物工艺发展的主要领域
细胞培养工艺技术
典型的细胞培养工艺开始于通过一系列尺寸不断增加的反应器（也称为种子扩增链）在悬浮培养中生长和扩增细胞，直到产生足够数量的细胞，来接种生产反应器。该过程与微生物发酵非常相似，只是需要更长的时间以及更复杂的培养基，才能满足哺乳动物细胞的营养需求；生产反应器的运行可能会持续十天以上，而不是典型微生物发酵的一两天。在生产过程中，对溶氧(DO)、pH 和温度等关键工艺参数进行在线监测，而对葡萄糖、乳酸和 CO2 等关键代谢物的浓度进行离线检测。
近三十年来，大多数细胞培养工艺采用补料分批模式，在细胞培养过程中加入浓缩的营养补液，延长生产周期，使细胞密度达到较高水平，使产物积累。在过去的二十年中，增强的工艺技术允许获得更高的细胞密度和产物浓度。对于IgG 等产品，滴度可能在 10 g/L 范围左右，当抗体产品在 1990 年代中期开始起飞时，这一水平是无法想象的。连续细胞培养，几乎总是与使用内置或外置的细胞截留装置相结合，以提高细胞密度和生产力，多年来一直被归类在容易降解或生产水平非常低的产品的解决方案当中。在过去的十年中，人们越来越关注更小的一次性反应器和连续培养，而不是使用大型不锈钢罐进行补料分批培养。
采用摇摆袋子或其它类型容器形式的一次性生物反应器主要用于种子培养制备或小规模生产。随着蛋白质产品及其工艺技术的成熟，降低商品成本的愿望也随之增加。与传统上基于不锈钢反应器的设施相比，使用一次性反应器的生产工厂需要更少的资本支出，并且建造时间更短。它还可以提高生产操作的灵活性。然而，基于塑料结构的一次性搅拌罐反应器的可放大性会有一定的限制。为了提高一次性生物反应器的生产率，解决方案是以连续模式运行。降低的培养基蛋白质含量和降低的膜污染，以及具有交替式切向流(ATF) 的细胞截留中空纤维装置的成功，也促进了连续操作的采用。
已经有小组进行了研究，以模拟通过ATF 中空纤维系统的流体动力学。评估了ATF 装置和流体传输管路中的细胞滞留时间对可能的缺氧和对细胞的流体动力学损伤（通过估计能量耗散）的影响。使用计算流体动力学(CFD) 模型来评估操作条件对通过 ATF 中空纤维的通量的影响，并显示跨膜存在反向流动，这种现象被称为“椋鸟巡回”流动，被认为可以减少结垢。
连续培养可以在稳定状态下运行，从而使细胞的生理状态随时间保持恒定，并可能提供更一致的产品质量。与批次培养中的最大生长速率相比，大多数连续细胞培养工艺的生长速率相对较慢。在低生长速率下，可以使用较小的细胞废弃速率来保持稳定运行。此外，较慢的生长速率有助于切换到低糖酵解通量状态。一种改善灌流培养的策略是通过降低温度或添加生长抑制性戊酸来减缓细胞生长，从而减少特异性乳酸生产、提高特异性氨生产，同时提高单克隆抗体(mAb) 生产力。
为了在灌流培养中保持恒定的细胞密度，一些人采用了经典的恒浊（turbidostat）策略，通过调整稀释率、补料营养浓度或细胞废弃率来保持细胞密度恒定。测量活细胞密度的在线电容探针通常用作控制手段。尽管如此，观察到细胞密度以及特异性速率的各种生长和代谢指标在很大范围内波动并不罕见。细胞代谢中变构调节的复杂性允许在给定的一组营养补液和稀释率操作条件下存在多种代谢状态。在这样的复杂系统中，系统达到的稳态受初始条件和培养趋势的影响。操纵启动培养条件可能会导致不同的稳定状态。然而，关于灌流培养动力学和控制策略的系统性讨论尚不多见。
产品质量和工艺分析技术
近三十年来，细胞培养生物反应器中使用的在线传感器仅限于用于测量pH、DO 和温度的传统传感器。化学分析仅限于离线检测或使用自动取样装置的近线检测，其通常仅限于更复杂的研究型反应器。近来，拉曼光谱已成为一种常用的在线传感器，用于监测各种营养水平，这基于其早期在细胞培养工艺中的应用。由在线拉曼光谱传感器获取的光谱通常经过多元分析或化学计量，以使用偏最小二乘法确定目的变量的浓度。在过去的几年里，它已被用于监测葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺和氨的浓度。定量检测的浓度范围大多在1mM范围或更高。研究已经表明，即使使用相对较少的数据集，也可以建立在线葡萄糖测量模型，并开发过程分析技术(PAT) 控制器，以将葡萄糖保持在低水平 (2 g/L)，同时降低产物蛋白质中的糖基化水平（即葡萄糖分子与蛋白质中氨基的共价结合）。
除了糖基化之外，还必须控制其它类型结构性异构体的丰度水平，包括糖基化、二硫键加扰和产物蛋白质的各种蛋白水解切割。与糖基化一样，二硫键断裂和重组发生在产物蛋白质分子分泌到培养基后。这发生在溶氧水平低或存在高水平还原剂的产品回收阶段。据报道，深层过滤中剪切损伤导致的细胞裂解会导致酶和NADPH 的释放，从而导致二硫键断裂。这可以通过在储存袋中保持较高的溶氧水平来缓解，从而降低澄清收获中的还原环境。如在生产IgG4-Fc 融合蛋白的细胞系中所见，宿主细胞酶的蛋白水解切割可能导致生产力降低以及最终产物中降解片段的污染。比较具有不同蛋白水解程度的细胞系的转录组可确定弗林蛋白酶是主要的作用蛋白酶，随后在培养物中使用弗林蛋白酶抑制剂可减少融合蛋白的降解。
分析技术的进步现在能够对蛋白酶消解的促红细胞生成素（EPO）-Fc 融合蛋白的单个糖基化肽上的N-聚糖进行表征。研究揭示了不同糖基化位点的不同聚糖谱，尤其是唾液酸和岩藻糖的丰度水平。此外，不同的培养基和不同的培养持续时间会导致空间分布的变化。聚糖异质性结构分辨率的提高将扩展我们对它们的生物学和临床意义的理解，并增强我们将它们控制在可接受范围内的能力。空间聚糖分布也证明了通过细胞工程或控制培养条件来操纵糖基化谱的复杂性。在同一项研究中，O-聚糖的组成也随着时间和不同的培养基而发生变化。在 EPO-Fc 上发现的少量 O-聚糖与中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞中预测的有限 O-糖基化网络一致。
产物中的宿主细胞蛋白 (HCP) 水平也必须控制在可接受的监管水平。残留 HCP 的一些酶活性可能会在长期储存过程中改变产品特性。蛋白质组学被用于识别污染性 HCP，促进它们从产品中的层析去除或敲除相关的基因，以缓解问题。除 HCP 外，存在于常用宿主细胞系基因组中的内源性逆转录病毒 (ERV) 在生物制造中具有安全性和监管问题。ERV 具有产生传染性病毒颗粒的“神秘”潜力。它们还可以转移、激活或灭活宿主细胞基因并改变宿主细胞。通过对Vero 细胞中 ERV整合位点的鉴定，表明细胞系建立后发生逆向易位的可能性非常低。
细胞系
许多哺乳动物宿主细胞系通常用于基因改造以生产产品，包括CHO 细胞、人胚胎肾细胞 (HEK-293)、小鼠骨髓瘤 (NS0) 和幼仓鼠肾(BHK) 细胞。然而，绝大多数治疗性蛋白质是在CHO 细胞中产生的。用于治疗性蛋白质生产的细胞系传统上是通过将含有目的基因(GOI) 的线性化质粒 DNA 随机整合到宿主细胞基因组中来构建的，然后筛选和扩增 GOI 拷贝数以确保高转录水平。使用这种方法会产生质粒 DNA 的连接体，无论是完整的还是片段的，并不是所有的 GOI 拷贝都是活跃的。最新的方法在将 GOI 序列插入宿主细胞基因组的随机位点或选定基因座时保持其完整性。可以使用转座酶系统对整个GOI 进行随机整合。与随机整合质粒相比，Leap-in Transposase被用于创建拷贝数更低的高产池，而piggyBac、Tol2和Sleeping Beauty转座被用于产生比仅使用质粒转染产量高得多的TNFR-Fc的高单位体积生产力池和克隆。
靶向整合方法将 GOI 引导至基因组结构稳定、转录活跃的位置，目的是提高细胞系开发的通量和一致性。使用慢病毒载体将不稳定的GFP (dGFP) 和 IgG 以及用于重组酶介导的盒交换 (RMCE) 的序列标签整合到CHO 细胞的基因组中。在通过流式细胞仪分选并建立细胞系而鉴定出具有单拷贝GOI 的高产克隆后，RMCE 位点可用于交换新的靶基因。另一项研究利用随机整合分离出高产量、稳定的抗体生产克隆，然后使用RMCE 去除抗体基因，创建用于靶向插入新GOI 的宿主细胞系。CRISPR/Cas9 被用于在同一位点为 RMCE 生成一个“着陆垫”，从而创建了一个稳定、高产的细胞系。在另一种情况下，将多个GOI 拷贝插入靶向整合宿主细胞系以提高生产力。
生产细胞系必须在产品生命周期内提供一致的生产力、生长特性和产品质量。由于缺乏对这些复杂性状的结构和生理学理解，生产细胞系的稳定性通过经验评估，重点关注易于观察的现象，如生产力和结构染色体稳定性。CHO细胞是非整倍体，具有广泛的染色体数目，从少于20 条到超过 60 条不等。这些染色体中有少数在显微镜下看起来正常，其余的则异常或由融合片段组成。CHO细胞的核型本质上在不同细胞系之间是可变的，并且随着细胞进行复制而随时间变化。这似乎与常用于病毒疫苗生产的绿猴肾细胞系Vero 不同。这种核型不稳定性是否会导致生产力的不稳定性尚不清楚。另一项研究表明，在重复单细胞克隆后，染色体数目的分布很快重新建立，而整合的GOI 的一个拷贝反复丢失，从而表明某些基因组区域的结构不稳定。
随着基因组工程的进步，各种更新的工具已被应用于工程宿主细胞。利用死亡Cas9的 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 已被用于敲除CHO 细胞中与凋亡相关的几种基因（Bak、Bax 和Casp3），从而降低半胱天冬酶活性并提高活细胞密度。CRISPR/Cas9用于敲除 PKM1（丙酮酸激酶肌肉同种型 1），这是CHO 细胞中糖酵解酶的一种次要亚型，导致后期培养中的增乳行为降低。苯丙氨酸-酪氨酸分解代谢中酶的过度表达或支链氨基酸分解代谢途径中 BCAT1 的敲除减少了补料分批培养中抑制性副产物的积累。预计在 CHO 基因组中编码内源性逆转录病毒的基因被敲除，导致细胞培养上清液中存在的逆转录病毒RNA 减少。宿主细胞工程可能会变得更加普遍，尤其是通过多基因操作来设计途径或性状，以创建具有理想代谢行为、生产能力和产品质量特征的细胞系。
由于各种原因，一些蛋白质难以高水平表达：对细胞的毒性、复杂的翻译后修饰或四级结构、或分泌后的不稳定性等等。细胞工程和蛋白质工程是可以促进此类蛋白质生产的工具。例如，作为呼吸道合胞病毒疫苗接种的潜在免疫原的膜蛋白已被改造并转化为可溶性分泌分子用于生产。已经在CHO 细胞中产生了一种高度糖基化的 HIV 囊膜蛋白三聚体，并且正在探索作为候选 HIV 疫苗。BMP-4（骨形态发生蛋白-4）是一种具有治疗骨折潜力的信号分子，由于其活跃的再内化，在 CHO 细胞中的生产力较低。硫酸葡聚糖对内吞作用的竞争性抑制提高了其生产力。一些难以表达的蛋白质，尤其是那些在过表达时对细胞有毒的蛋白质，例如离子通道，可以使用CHO 细胞裂解物在无细胞系统中产生，从而产生功能性、正确折叠的蛋白质。对于此类应用，将需要经过工程改造以消除竞争反应并提高表达效率的CHO 细胞。
组学和系统方法
在过去几年中，基因组、转录组和一些表观基因组分析已广泛应用于研究培养中CHO 细胞的不同方面。对 22 种 CHO 细胞系线粒体基因组的序列分析显示了大量的序列变体，但其中大多数是细胞系特异性的，包括许多蛋白质编码基因。毫不奇怪，大多数变体是异质的，变体在细胞系中以不同的比例存在。因此，即使是功能缺失的突变也会在细胞系内的某些线粒体中携带。这些变体可能会或不会导致细胞系或工艺的变异性。有研究通过对两种不同产品的多个高产克隆的转录组分析，鉴定出了一组与高产相关的候选基因。随后，参与蛋白质折叠和二硫键形成的Erp27 和 Erp57 以及转录因子 Foxa1 的各种组合的过表达导致了生产力的提高。
除了基于 CHO 细胞的蛋白质治疗药物生产外，其它细胞培养工艺，包括用于疫苗和基因治疗应用的病毒生产，也可能受益于组学工具。用于疫苗生产的许多细胞系都是人类来源的，可以使用经过良好注释的基因组。疫苗生产中常用的两种非人类细胞系Vero 细胞和 MDCK 细胞分别来自非洲绿猴和狗。许多不同品种的狗基因组早已可用，Vero 细胞的基因组也已测序。与非洲绿猴的参考基因组（Vero 最初来源于该基因组）相比，Vero 细胞中12 号染色体的 9 Mbp 区域被纯合子删除。丢失的基因中包括 I 型干扰素基因簇，使细胞更容易受到病毒感染，并且更有效地产生病毒。
我们将越来越多地看到细胞生物工艺中的多组学研究。使用转录组学和代谢组学分析，UDP-半乳糖的供应减少被确定为后期培养中糖基化模式变化的可能根本原因，而这一瓶颈可能是由于代谢转变为低糖酵解通量状态。在培养后期补充半乳糖提高了整体半乳糖基化水平。
虽然基因组和转录组数据的分析需要生物信息学工具，但代谢网络模型对于从代谢组数据中获得洞察力是必要的。大多数代谢网络模型都基于化学计量平衡。由于系统总是被低估，计算的通量取决于选择的目标函数和使用的求解算法。碳同位素标记用于确定关键代谢分支反应之间的碳通量拆分并约束通量分析解。在这一领域已经取得了重大进展，并且已经确定了以前可能被忽视的反应。此外，已经为几种CHO 宿主细胞系开发了基因组规模的代谢模型，可用于更好地了解不同生物工艺处理和细胞系工程努力的影响。值得注意的是，哺乳动物细胞的新陈代谢是分门别类的。在不考虑分区的情况下，氧化还原平衡甚至碳流都会出现偏差。然而，氨基酸代谢和回补中一些关键反应的划分仍不完全清楚。因此，这些模型需要随着新知识的出现而更新。有些人从动力学的角度使用机械动力学模型来模拟新陈代谢。糖酵解、Krebs循环和戊糖磷酸途径的机械动力学模型被用来识别基因表达改变的组合，这些改变可以将葡萄糖代谢重新连接到低通量状态，同时满足作为生长要求的约束条件。
使用组学分析的一个结果是通常会增加与细胞相关的任何问题的参数空间。可用于探索更广泛参数空间区域的多重细胞培养实验现在已在工业生物工艺开发中常规实施。这种类型的设备，例如ambr 系统，可以自动补液和取样，并且能够控制pH 值。这些多重培养装置已用于通过周期性重力细胞沉降和培养基置换来模拟灌流培养。多重设备经常用于规模缩小研究，旨在模拟生产反应器的条件。为了利用高通量实验的力量，应该采用系统方法来整合生物反应器的操作、细胞生理学和生长。当规模发生变化时，与生物反应器相关的许多物理参数，包括通气率、机械应力和传质率，也会以不同的比例发生变化。物理性质的变化会导致化学环境的变化，进而改变细胞的生理机能。这些生理变化进一步改变了化学环境，形成了一个反馈回路。系统模型可以整合细胞的物理效应、化学环境和生理状态，以模拟细胞生长、代谢状态和反应器环境。它可以成为评估不同生物反应器规模的工艺性能的强大工具，并且可以帮助设计捕获规模转换中的关键参数的实验。
展望未来 – 总结
蛋白质治疗药物目前构成细胞培养产品的最大比例。然而，值得注意的是，细胞培养工艺植根于病毒疫苗。七十年前，贴壁细胞已适应悬浮生长，用于生产口蹄疫病毒。SARS-CoV-2病毒的出现使人们重新关注疫苗技术。除了疫苗之外，作为基因递送载体的病毒以及用于治疗用途的免疫和干细胞的开发也在加速。目前生产自体细胞疗法的工艺是个性化的，因为患者的治疗需要他们自己的细胞。生产一剂产品所需的培养体积对于疫苗来说约为几毫升，对于治疗细胞和病毒载体来说约为一升。
对于CAR-T细胞等个性化的自体细胞产品，生产规模因此相当小。相反，一些疫苗和病毒载体的生产规模与蛋白质生物药相似。对于个性化应用，通过自动化以减少手动步骤的需求已经引发了很多开发工作。对于细胞治疗、疫苗和病毒载体应用，细胞培养工艺与生物药的生产过程非常相似，重点是部署一次性设备，实现高细胞密度；对于细胞治疗应用，保持产物细胞处于高活性和效力状态。对于这些工艺，针对传统生物药生产而开发的技术很容易被采用，包括用于高密度连续灌流的设备以及在线电容和拉曼光谱传感器。
在新兴的细胞和基因治疗领域，关于工艺的公开信息很少，例如细胞生长动力学和产物细胞质量。对于个性化医疗应用，非常需要了解来自不同个体的细胞的内在差异，这可能导致它们的扩增和临床潜力截然不同。对于基因载体生产，需要更好地控制病毒生产过程，以最大限度地减少重组病毒基因组有缺陷以及无效病毒颗粒的比例。增加工艺研究工作以填补这些知识空白，将加速从临床研究和生产向成熟制造的过渡。
最后，蛋白质生物药的成功继续推动着工艺技术的进步，而这些工艺技术的进步反过来又推动了该行业的成功。在这个相互促进的循环中，我们看到了工艺创新的机会。我们也看到了促进创新的各种经济技术和系统设计的潜力。许多生产工艺在产品的生命周期内积累了大量的数据、信息和知识。这些过程对于机器学习来说已经成熟，可以进一步挖掘过程潜力。不用说，系统分析和设计依赖于系统模型。系统模型的基础是过程的核心，即细胞代谢、合成和生长。将生物动力学与反应器以及过程动力学联系起来将允许进一步的工艺增强，并为新兴细胞技术开发先进的制造过程提供一个框架。
原文：S.A.O’Brien, W.Hu, Cell culture bioprocessing — the road taken and the path forward. Current Opinion in Chemical Engineering 2019, 30:1–7.
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