用于动物细胞培养连续生物工艺的灌流培养基开发
本文节选自“Perfusion Medium Development for Continuous Bioprocessing of Animal Cell Cultures”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
哺乳动物细胞培养的传统生物工艺以批次或补料分批模式操作。为了增加时间-空间产量、降低商品成本、加快上市时间并在更小的实验室占地面积的情况下提高灵活性，灌流工艺被设想用于各种生物工艺强化任务。动态灌流的目标是通过在长时间内保持高比生长率来实现高活细胞密度(VCD)。它通常以高灌流速率运行，以产生建立高密度冻存细胞库所需的生物量，或作为N-1 阶段的接种物，用于作为（强化）补料分批或浓缩补料分批运行的大型生产生物反应器培养。动态灌流操作可以切换到以低灌流速率和恒定高VCD 持续数周甚至数月的连续、稳态灌流培养，以高效生产高质量的产品。根据灌流操作的具体目标，合适的培养基应支持最大的生长或生产力。
灌流培养基和工艺条件的最佳组合扩展了活细胞浓度和活细胞密度积分（IVCD，也称：细胞天数），远远超出了基于批次的培养所能达到的水平（图 1A）。当可以保持细胞特异性生产率 (qP) 时，通过增加 IVCD 值，获得的产品产量明显更高（图 1B）。最大的挑战之一是营养物质的累计消耗和有毒废物的产生，此处以葡萄糖和乳酸为例（图1C 和 D）。IVCD 图的斜率可以更深入地解释细胞性能并表达常见的细胞培养参数，包括细胞特异性生长 (μ)、- 生产力 (qP)、- 葡萄糖消耗 (qGluc) 和 -乳酸生产 (qLac)。
图1. 与生产重组抗 HIV 抗体PG9的重组 DG44 细胞系的批次（橙色）以及补料分批（蓝色）相比，灌流培养（绿色）的优势。灌流在高活性或代谢生产力条件下，获得高活细胞密度积分（“细胞天数”或“IVCD”）。
灌流培养中的营养物水平可以在两个水平上进行控制。首先，通过培养基组成，其次，通过控制与补料分批优化相似的进入生物反应器的补液。一个主要的区别是，在灌流过程中，通过调节耗竭培养基的连续流出速度，从培养物中去除了产物和有毒副产物，而在补料分批过程中，有毒产物滞留在培养罐内，并且产品还被暴露于“垂死”细胞释放的酶。因此，必须针对给定的细胞系和相应的培养基开发平衡的灌流流速，以提供足够的营养物质，并有效去除有毒废物。
低细胞特异性灌流速率 (CSPR) 的概念可作为高性能灌流培养基的关键标志
优化的灌流培养基以最低的灌流速率支持健康的细胞生理需求。新培养基的典型设计目标是达到最低的细胞特异性灌流速率(CSPR)，以降低总体培养基消耗、提高收获滴度、降低储存罐尺寸以及实验室占地面积。本质上，CSPR描述了每个细胞每天的灌流培养基体积。文献中已经描述过20 pL/cell/day的最低 CSPR。平均细胞直径为 13 μm 的球状 CHO 细胞定义为1 pL 细胞量，这意味着在20 pL/cell/day的条件下，细胞体积20倍量的培养基通过反应器。进一步假设快速生长的细胞具有高达400 pg/cell/day的特异性葡萄糖消耗率，我们的灌流培养基必须在20 pL 培养基体积中提供 400 pg 葡萄糖，转化为 20 g/L 的葡萄糖浓度。如果我们将灌流速率提高到40 pL/cell/day的 CSPR，我们的培养基仅须包含 10 g/L的葡萄糖浓度即可支持细胞的葡萄糖需求，而如果我们想将CSPR 降低到 10 pL/cell/day，我们必须提供40 g/L 的葡萄糖浓度。这种计算也适用于毒性废物。我们观察到快速生长的细胞产生高达50 pg/cell/day的乳酸。这导致在 20 pL/cell/day的灌流速率下最终乳酸浓度为2.5 g/L。如果我们将CSPR 降低到 10 pL/c/d，这将转化为 5 g/L 的乳酸，或者在40 pL/c/d的更高灌流速率下降低到 1.3 g/L。高产重组细胞系可产生高达 20 pg/c/d的重组蛋白。在10、20 和 40 pL/c/d的CSPR 下，这分别累积成 2、1 和0.5 g/L 的滴度。
当我们将边界推向灌流培养中最低的CSPR 时，我们必须应用高度浓缩的培养基并仔细考虑毒性代谢物的较低去除和临界浓度。此外，在较低的灌流速率下，蛋白质产物的滞留时间增加。对于抗体等稳定的产品，较低的灌流速率是可行的，这会导致收获液中的产品滴度更高，并使灌流成为使用紧凑、简便形式的一次性设备进行生物工艺强化的一个有吸引力的概念。开发用于低CSPR 的高浓度灌流培养基也使我们能够应用恒化器模式。与细菌相比，哺乳动物细胞的特异性生长率低，因此运行恒化器需要支持低稀释率。
利用现有平台培养基设计新的灌流培养基
与基于批次的传统工艺相比，细胞培养基很大程度上决定了灌流培养性能、最终产品产量和产品质量。细胞培养基设计用于改善细胞生理学（生长和生产力）、适当的物理化学特性（粘度、减少泡沫、适当的氧气溶解度、pH、缓冲能力等）和稳定性（储存、保质期、降解）。所谓的平台培养基是针对上游工艺中的多个步骤开发的，包括解冻、常规培养、生物量扩增、生产和冻存。如今，可以使用广泛的基础培养基和不同的补液添加物，来获得均衡的碳水化合物、氨基酸、脂质、维生素、有机酸和微量元素。
在过去，这种现成的培养基通常是专门为传统的补料分批应用而设计的，在过去的几十年里，关于培养基成分如何影响细胞培养的知识已经积累了很多。现在，我们的任务是结合这一广泛的知识体系并将其用于新的生物工艺。一种策略是使用现有的平台培养基并将其与某些添加物结合进行灌流。在补料分批工艺中，有必要通过准确定时添加高度浓缩的补液溶液来提供一组平衡的营养物质，以保持培养物的低渗透压。营养物质通过每日输入或连续补液来维持，但有毒副产品会积聚并滞留在培养液中。优化是通过 a)高度浓缩的补液溶液的组成和 b) 确定最佳补液方案来实现的。相反，灌流培养基通过连续的培养基液流输送营养物质，同时去除有毒废物。因此，灌流工艺的开发涉及优化 a)灌流培养基的组成和 b) 确定最佳灌流速率。尽管培养基成分和过程控制存在差异，但平台培养基的有益特性可以跨多种操作模式转移，并针对连续灌流或恒化器培养进行微调。
灌流培养基开发的支持技术
尽管有各种复杂的培养基和补液溶液可供使用，并且可以作为专门设计新灌流培养基的起点，但必须筛选许多变量以找到有关营养物浓度、渗透压、pH、缓冲能力、氧/CO2 溶解度以及高细胞密度下灌流速率的最佳值。为了成功完成这项复杂的任务，需要多因素方法和工具来找到全局最优值。
细胞培养基设计的传统方法包括合理性方法，例如通过耗竭培养基分析来鉴别限制性或有毒化合物浓度，以及经验性方法，例如培养基混合，以结合各种独立培养基溶液的益处。通过HPLC、GC、LC-MS 和GC-MS 或 NMR 和拉曼光谱进行色谱分析可以帮助鉴别灌流收获液中不必要的高营养浓度，并检测生理条件下的营养物稳态。
与传统的一次一个因素 (OFAT) 方法相比，实验设计 (DoE) 与响应面建模相结合已被证明特别有利，可识别最佳“因素”（即物质）及其“水平”（即浓度）和“因素相互作用”。此外，当必须筛选和优化许多不同的因素和水平时，DoE降低了实验成本，并从有限数量的实验中提取最大信息。
对大量不同培养条件的研究需要应用许多并行培养，这些培养可以以最少的资源，使用高通量小批量操作。稳健且可重复的小规模模型通常用于批次和补料分批应用，但现在也需要用于灌流工艺的开发，以模拟大型生物反应器培养的性能并预测关键参数，包括细胞生产力、蛋白质质量以及关键工艺参数，例如最小CSPR 或最佳的每日细胞废弃（bleeding）量。与批次/补料分批模型相比，必须使用适当的技术来实现连续培养基添加和收获液去除，以有效地截留细胞或控制细胞废弃。由于较高的复杂性且缺乏合适的小规模细胞截留装置，只有有限的小规模概念和小型化生物反应器可用。规模缩小模型最好在几毫升的工作体积下运行，以减少总体培养基消耗。这意味着在连续运行时必须应用非常低的培养基流速。对于10 mL 的工作体积，如每日灌流速率为 1 vvd，必须支持低至每分钟 7 μL 的流速。对于具有连续培养基流动的真正灌流，这需要合适的可用微流体系统。另一种方法是以规定的时间间隔进行液体转移。例如，每天10 mL 的平均灌流量可以通过使用 0.5 mL/min 的小型蠕动泵来实现。每 6 小时 5分钟，或每天 20 分钟。然而，在这种半连续培养中偏离真正连续的灌流操作会导致峰滴度和代谢物趋势的波动，这可能会严重影响细胞行为和最终产品质量，因此必须仔细评估。
半连续灌流培养定义为使用离心分离细胞培养上清液的每日培养基置换，并模拟在任何细胞培养实验室都容易获得的简单摇管或烧瓶中的灌流模式。这种具有成本效益的培养模式可由单个操作员以高通量方式操作，并为灌流工艺提供了有吸引力的小规模替代方案。然而，标准摇管没有配备用于测量pH 值和溶氧 (DO) 的传感器和控制器。因此，最近行业在努力开发更复杂的小型化生物反应器，以非常小的工作体积（50-200mL）真正连续灌流运行，并具有适当的DO 和 pH 控制。
挑战和未来方向
一旦使用适当的小规模模型通过合理或经验方法确定了合适的灌流培养基，最终培养基还必须满足质量、稳定性和可制造性等几个属性。针对操作目的，首选培养基的粉末配方，以延长保质期、最小化存储体积并便于运输到不同地点。必须制定针对所有组分液体复溶的适当方案，并且可能包括对中等粉末进行造粒以加快大规模溶解时间。通过现场稀释培养基浓缩液来提供长时间（稳态）灌流运行所需的大量培养基，以减少存储和实验室空间。应采用适当的方法来检测、监测和控制由热和光引起的培养基降解，并可能包括结合化学计量工具的光谱(RAMAN) 方法。
目前已经开发了支持低至 20-40 pL/c/d的极低 CSPR 的高浓缩灌流培养基，但这带来了两个挑战：首先，对于小规模模型，在连续运行中使用微流体系统需要非常低的流速。或者，传统的蠕动泵以规定的时间间隔运行。其次，有毒副产品在低灌流速率下积累。因此，必须鉴别所有有毒细胞代谢物并了解它们的代谢网络，以最终通过细胞（代谢）工程、培养基设计或过程控制来控制它们的生物合成。
最近的培养基设计方法还旨在包括系统生物学方法，以更详细地了解培养环境对细胞生理学的影响。也可以使用支持传统培养基开发的各种组学技术。我们使用转录组学来研究补液添加物对具有高生产力的细胞系的细胞影响。此外，代谢通量分析或细胞蛋白质组的表征是非常适合以产物和细胞特异性方式、通过培养基设计来理解和修饰细胞生理学的概念。新方法旨在通过使用化学计量或动力学模型的机械建模来在硅设计培养基。事实上，生产滴度已显著提高的事实，将在不久的将来，更多地把培养基开发的挑战转向优化产品质量。对于抗体，电荷、尺寸和糖型异构体分布被定义为这样的关键质量属性。
原文：P.Mayrhofer, R.Kunert, Perfusion Medium Development for Continuous Bioprocessing of Animal Cell Cultures. American Pharmaceutical Review, 2020.
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