中山大学陈新滋院士/熊小峰教授课题组：可逆性半胱氨酸修饰导向的赖氨酸位点选择性装订及单位点修饰

多肽及蛋白的位点选择性修饰是研究翻译后修饰的重要途径，并在药物发现中发挥着重要作用。与从头合成及化学生物学方法相比，天然多肽或蛋白分子的位点选择性化学修饰提供了更简便的途径来实现其功能化。目前已有大量方法被报道用于氨基酸残基的选择性修饰，然而这些方法主要是针对某一种氨基酸残基进行化学选择性修饰，而针对某一特定位点的氨基酸进行位点选择性修饰报道相对较少。赖氨酸作为一种具有高亲核性的氨基酸，与半胱氨酸相比具有高的自然丰度以及高溶剂化的性质，且广泛存在于翻译后修饰中，使得其位点选择性修饰具有相当大的挑战性。

本文中，作者通过组合半胱氨酸选择性的芳基硫醚及赖氨酸选择性的邻硝基苄醇衍生物，首先利用课题组前期发展的芳基硫醚对半胱氨酸进行可逆性修饰，从而达到暂时锚定的作用，再通过邻硝基苄醇片段来实现对半胱氨酸临近赖氨酸的位点的选择性装订。芳基硫醚修饰的半胱氨酸既可以作为一个装订位点，也可以在硫醇作用下去修饰恢复游离状态，从而实现对赖氨酸的选择性单位点修饰（图1）。

图1. 半胱氨酸导向的赖氨酸位点选择性装订及单位点修饰

在最优反应条件下，作者首先考察了不同装订试剂对反应的影响，结果表明具有不同长度连接子的装订试剂，以及引入了羟基、生物素及叠氮基等生物相关基团的装订试剂均可以与多肽高效率反应。

图2. 装订试剂底物拓展

随后，作者对多肽底物进行了考察。当半胱氨酸与赖氨酸之间间隔氨基酸数为一到七时均以较好的收率获得目标装订产物，说明了该方法对赖氨酸高的化学选择性。当多肽同时含有一个半胱氨酸和两个赖氨酸时也以中等至较高收率获得双环化产物，说明了方法的可用性（图3）。

图3. 半胱氨酸导向的赖氨酸装订及双环化

在确定好该方法的效率及化学选择性后，作者进一步对同时存在多个赖氨酸残基的多肽底物的位点选择性进行了考察。首先进行标准Cys-Lys装订反应，反应结束后原位加入硫醇使得暂时锚定的半胱氨酸恢复游离状态，从而实现半胱氨酸临近赖氨酸的选择性单位点修饰。结果表明当多肽同时含有两个或三个赖氨酸时，均以良好的选择性和收率获得目标产物（图4）。

图4. 半胱氨酸导向的赖氨酸选择性单位点修饰及多功能化

最后，作者对该装订方法对蛋白的适用性进行了考察。具有不同长度连接子及含有叠氮基的装订试剂均以较好的收率得到了半胱氨酸临近赖氨酸位点选择性装订产物，进一步说明该方法的实用性（图5）。

图5. 蛋白半胱氨酸导向的赖氨酸位点选择性装订

中山大学药学院博士研究生李坚为文章的第一作者，陈新滋院士、熊小峰教授为共同通讯作者。详见：Jian Li, Qi-Long Hu, Zhendong Song, Albert S. C. Chan, Xiao-Feng Xiong. Cleavable Cys labeling directed Lys site-selective stapling and single-site modification. Sci. China Chem., 2022, 65(7): 1356-1361.

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