曾与诺奖失之交臂、人小鬼大的miRNA如何改变细胞命运？
编者按：
俗话说，到什么山唱什么歌，事物都会随着位置环境的改变而变化。1993年，美国科学家维克托·安博斯在线虫中发现了第一个miRNA，他的惊人发现不仅掀起了如今已蔚然大观的miRNA研究热潮，也同时为miRNA的研究定下了一条“铁律”，即miRNA通过结合3’UTR在细胞浆中抑制基因的表达，否则就难以讲述一个完美的故事而难成主流。但复旦大学生物医学研究院于文强课题组发现，与细胞浆的miRNA作用相反，细胞核内miRNA（NamiRNA， Nuclear Activating miRNA）主要发挥系统性的基因激活作用，胞核和胞浆位置的变化使miRNA成功实现角色转换。本专栏由复旦大学教授于文强组织策划，邀请了国内外表观遗传学领域学者共同完成，希望通过本专栏让公众更好地了解表观遗传领域近年的发展概况以及它是如何解释我们日常有意思的生命现象。
撰文 | 梁英 (复旦大学生物医学研究院博士生)
责编 | 叶水送
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每个女孩内心深处都渴望青春永驻，拥有婴儿般吹弹可破的细腻肌肤，可是无奈岁月的刻刀，毫不留情在脸上留下深深浅浅的印痕，皱纹一来便是排山倒海，不可思量，这如同梦魇般的事实，简直让人辗转反侧，夜不成寐。精明的商家窥探到这一秘密，于是向爱美人士大力鼓吹护肤神器，有些产品就应用了miRNA与肌肤衰老相关的原理，他们比较了年轻肌肤与衰老肌肤中的miRNA，筛选出与调控皮肤蛋白息息相关的三条miRNA：miR-29，miR-34， miR-203。从天然产物中分离出抑制这三条miRNA的成分，进而起到抗老化、增强皮肤弹性、减轻皱纹的一系列效果。其真正的作用机制和作用效果应该是有待时间的检验。为了爱美，很多人甘当小白鼠。
不过，这也说明人类从基因层面以及表观遗传角度，有可能创造与时间抗衡的办法，miRNA的发现恰与皮肤相关。研究者在做实验时发现在线虫中突变不同基因片段，幼年线虫的柔嫩皮肤变的又老又皱，而老年线虫的皮肤竟然变得又嫩又软。接下来，让我们来追溯一下这个在人体庞大基因组中仅有约21个碱基的单链片段的历史。
人小鬼大的miRNA，曾与诺奖失之交臂
miRNA的发现，与一位祖籍波兰的生物学家维克托·安博斯（Victor Ambros）的工作有关——他在线虫中发现了第一个miRNA lin-4。
上个世纪50年代，安博斯出生于美国东北部新罕布什尔州，从小受其父亲的影响，他喜爱阅读及动手制作一切他认为新奇的小玩意儿。上世纪60年代，美国阿波罗飞船登月成功，如同那个年代的很多年轻人一样，安博斯也想成为一名宇航员，直到1971年他进入麻省理工学院学习天文知识时，发现自己的物理算术能力一般。睡在他旁边的室友好几个晚上与他深夜讨论分子生物与基因组学，于是他把兴趣爱好又转接到了分子生物科学，继而在博士期间师从诺贝尔奖获得者戴维·巴尔的摩（David Baltimore），从事线虫相关的研究。
时光飞逝。1993年，安博斯在哈佛大学成立了自己的实验室，他发现突变lin-4的成年线虫，长出幼嫩的皮肤，而突变掉lin-14的幼年线虫，则会长出皱皱的皮肤，原因竟是在线虫中lin-4可调控lin-14并抑制它的表达。Lin-14蛋白在幼年线虫中大量富集，而在成年线虫大量减少。所以突变掉lin-4后，lin-14会增加， Lin-14蛋白的大量富集会使得成年线虫长出幼嫩皮肤。
安博斯早期以为lin-4是某种蛋白质，结果这种具有调控功能的分子竟是一种只有21个碱基的RNA分子，这让安博斯感到非常意外。该研究最终发表在鼎鼎有名的Cell杂志上。可以说安博斯当时的发现，开拓了科学家们对细胞内非编码RNA，也就是不参与编码蛋白质的RNA生物学功能的认识。然而该发现的前瞻性，并未引起很多科学家的重视，因为miRNA在当时被认为不具有普遍的调控意义，很多问题难以被解释，或许连安博斯本人也认为miRNA lin-4对lin-14的调控只是个例，因此也未对此进一步研究。此后一段时间miRNA的相关研究基本处于停滞状态。直到2000年，第二个miRNA let-7被发现，人们终于开始意识到miRNA对基因调控具有普遍意义。
► Victor Ambros
转眼到了2006年，当年的诺贝尔生理或医学奖颁给了安德鲁·法尔（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello），以表彰他们在RNAi（RNA干扰，指某些双链小RNA能够沉默基因表达的现象，这一类小RNA也被称作siRNA）领域做出的贡献。但许多人认为，首次发现miRNA的安博斯同样应该在诺贝尔奖的历史上留下名字。由于诺贝尔奖评选委员会很少会针对同一个领域重复颁奖，所以尽管安博斯曾一度被提名诺贝尔生理或医学奖，却最终失之交臂。如果当时安博斯继续坚持对miRNA进行研究，是不是少留一份遗憾呢？
多年之后，我们不得不承认，无论是法尔和梅洛，还是发现首个miRNA的安博斯，他们都对表观遗传学的研究开辟了新方向。表观遗传包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等研究，RNAi和miRNA的研究都属于非编码RNA的范畴。
简单来说，生物体内的RNA可分为两种：一种是可编码的，即参与编码蛋白质——遗传物质DNA转录生成mRNA（mRNA，也就是信使RNA，由DNA转录而来，能进一步翻译蛋白质），信使RNA进一步翻译生成蛋白质；另一种是不能编码的，即非编码RNA。miRNA正是后面这种非编码RNA中的一种，由于它的长度很短，仅有21-23个核苷酸组成，因此称作miRNA。
从发现第一个miRNA到现在已有20多个年头，miRNA的研究目前可谓是进入了井喷时代。根据miRBase的数据统计显示，当前已发现的人类miRNA前体有1881条，成熟miRNA有2588条。随着miRNA 相关研究不断推进，miRNA在肿瘤发生发展过程中的重要作用也不断地被揭示出来，肿瘤细胞十大特征的维持，均有miRNA参与。肿瘤细胞中存在miRNA 的异常高表达，这些高表达的miRNAs 通过靶向基因3’UTR 区域，干扰靶基因，尤其是肿瘤抑制基因的正常表达，导致正常细胞获得了癌细胞的生物学特性。
► miRNA是非编码RNA的一种
miRNA研究中的选择性无视现象
可以说，miRNA的作用是“Working anytime anywhere”，对它的研究也呈现出白热化的状态。不管是什么研究方向，科研工作者纷纷挤入miRNA研究之门。但是，我们也应该看到，近几年，miRNA的研究由于其思路单一化、缺乏创新性而有慢慢变冷的趋势。正如鲁迅先生说：这世间其实地上本没有路，走的人多了，也便成了路。可是，走的人太多，就成了套路。miRNA研究的人越来越多，创新却越来越少。
几乎所有的研究都认为miRNA在细胞浆中通过结合靶基因3’UTR抑制翻译或降解mRNA，如果信使RNA被降解，那么对应的蛋白质不能被翻译，可能造成相应的生理功能障碍，进而发挥负向调控作用，抑制靶基因表达。事实上，大部分这类研究常常沦为了典型的“马后炮”（miRNA对已经存在的基因发挥抑制作用，而很少从根本上调控基因的转录）。然而当miRNA作用于细胞时，基因芯片检测总是会发现一些基因下调，也有一些基因上调。受以往的“抑制理论”影响，我们总是在下调的基因中寻找miRNA的靶基因，即使在上调基因中勉强找到某个基因与这个miRNA功能相关，我们还是必须找到这个基因的 “Repressor” （抑制子，抑制靶基因表达的基因片段），然后通过“Repress Repressor”来讲述一个“完整”的miRNA故事。这样miRNA上调基因的相关研究则被“选择性无视”（selectively neglected）。
► miRNA抑制翻译或降解mRNA的负向调控机制
与此同时，通过对定位于细胞核和细胞浆的miRNA测序，许多miRNAs存在于细胞核中（要知道，以往对于miRNA的研究大都是默认在细胞浆中），后续研究也证实这些miRNA定位于细胞核中，但其功能并不清楚。
是不是这些定位于细胞核内的miRNA在基因的表达调控过程中发挥着重要作用呢？如果miRNA负向调控机制不能完全解释所有的调控现象，有没有新的理论来补充并撑起未来miRNA研究的一片蓝天？在纷扰繁杂的科研热点中， miRNA研究要怎样站住脚，它的出路在哪里呢？
一身二任：除了抑制，还能激活
科学的发展总伴随两面性。那些“跟风式”的研究可能暂时存在于科研的舞台，但是迟早会淹没于历史的汪洋中。除了miRNA负向调控，有些个案报道在特殊情况下miRNA能够促进基因表达或翻译，但其确切的作用机制还不够明确。遗憾的是，目前为止人类的2588条成熟的miRNA，尤其是新近发现的miRNA，大部分功能都聚焦在miRNA的负向调控的作用机制上，对任何一个miRNA的功能研究，几乎都是千篇一律地找到对应的靶基因，并对其负向调控的作用机制进行阐述，进而与肿瘤控制与靶向治疗相关联。
随着人类基因组计划的顺利完成，我们已开始迎接后基因组时代的到来。ENCODE 作为后基因组时代重要的发展计划，很多研究表明miRNA 定位于细胞核中，虽然其功能并不清楚，但天生我材必有用，我们相信这些定位于细胞核内的miRNA 在基因的表达调控过程中一定发挥着某种重要作用，而且这些miRNA 所发挥的功能应该不同于传统的细胞浆miRNA。
另一方面，一些定位于核内的miRNA是具有组织特异性的，也就是说，特定的miRNA在一些特定的组织中高度富集而在其他组织中低表达甚至不表达。比如，miR-1在肌肉组织中高表达，miR-124在中枢神经系统中特异性表达。有意思的是，增强子（enhancer），这种能强化转录的DNA序列片段，也具有组织特异性，比如之前朋友圈里流传甚广的“蛇为什么没有脚？”的故事中（简单来说就是敲除小鼠染色体上的增强子序列ZRS，小鼠不会长出四肢，而给敲除ZRS后的小鼠重新补上缺失的序列，小鼠又会长出四肢），决定四肢的增强子ZRS会高度富集在四肢中来维持四肢的正常发育发展。那么，具有组织特异性的核内miRNA是不是与增强子有关联呢？如果有，核内miRNA又是怎样与增强子相互协调，决定组织细胞的特异性？
► 缺失增强子ZRS的小鼠长不出四肢，而把缺失的ZRS片段补上，小鼠长出了四肢，图片来自Kvon et al., 2016.
有意思的是，复旦大学生物医学研究院于文强课题组近期的研究工作发现，许多miRNA自身在基因组的位置与增强子区域高度重合，如hsa-miR-26a-1、hsa-miR-3179和hsa-miR-24-1等。这些miRNA大多能定位于细胞核内。进一步研究发现，这些miRNA能够与增强子结合，并在全基因组的水平上激活基因表达。
进一步研究发现，miRNA的这种特性并非是个例，而是适用于很多组织和细胞。在研究miRNA自身的表观遗传学调控机制时，我们在7种不同的组织细胞中，对1594条miRNA前体进行了系统分析，意外地发现有300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志H3K4me1或H3K27ac高度重叠，这让我们将同时具有组织细胞特异性的miRNA和增强子这两个重要的分子生物学事件联系起来。我们发现，这些核内miRNA的激活作用依赖于增强子的完整性，如果敲除增强子所在位点的某段序列，miRNA便不能发挥上调作用，同时肿瘤细胞的增殖与迁移能力都受到影响。
► miRNA所在的基因组位置与增强子区域的重叠分析（图中H3K4me1和H3K27Ac为增强子表观遗传修饰标记）
基于此，我们认为：miRNA是重要的双功能分子。当miRNA位于细胞浆时，它可以作用于mRNA 3’UTR区域，如同灭火器一样，阻断mRNA的翻译进而发挥基因的负调控作用；与此相反的是，当它位于细胞核中时，就像一个点火器，通过结合增强子改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达。
► miRNA在胞浆与胞核中的双向性功能
我们把定位于核内并有激活作用的RNA称为NamiRNA（Nuclear activating miRNA）。基于此，我们提出了NamiRNA-增强子-靶基因网络激活模型，用于揭示细胞核内miRNA功能。这一激活模型能解释很多之前研究中不能解释甚至被刻意忽略的研究现象（比如肿瘤细胞中除了下调基因，上调基因怎么解释）。
令人惊喜的是，NamiRNA与靶基因存在直接的正向调控关系，它还参与肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭等生物学行为。虽然NamiRNA现在刚起步，踽踽独行难免寂寥，但未来如果能深入探讨研究，NamiRNA的正向调控理论无疑会帮助解释更多的生物学现象，应用于更多的研究领域，为肿瘤的临床诊断和治疗提供新的线索和策略。
如果你想进一步了解NamiRNA的研究技术和方法，并对细胞核内的miRNA功能研究或NamiRNA研究感兴趣，请您点击文末的“阅读原文”，了解更多信息。
参考文献
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