从mRNA药物分子设计到免疫反应------聊一聊基于mRNA的癌症疫苗（上篇）

Original 向阳屯铁匠细胞与基因治疗领域 2022-06-21

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在2020年之前，提到疫苗大家可能只会想到灭活疫苗、病毒载体疫苗，而在COVID-19肆虐全球之后，相信所有人都了解到了一个疫苗新品种----mRNA疫苗。在2020年，Moderna与BioNTech以史无前例的速度推动了两款新冠疫苗的研发与上市，让上亿的人群免受COVID-19的重症侵害。同样的，mRNA疫苗技术也为治愈癌症提供了新的武器，本系列文章小编就带大家从药物分子设计到免疫反应等方面聊一聊基于mRNA的癌症疫苗，本次（上篇）小编主要为大家介绍mRNA药物分子设计。

在十年之前，大家对mRNA疗法并没有投入大量的关注，这主要是有以下三点的考量：① mRNA 非常的不稳定，极易被降解；②外源的mRNA进入到细胞内，会有很高的先天免疫原性；③ mRNA在体内的递送效率非常低下。但在在过去的十年中，重大的技术创新和研究投入使mRNA成为疫苗开发和替代蛋白质治疗领域的非常前景的治疗工具。

1. 新的mRNA的5’ Cap 加帽方法

在真核生物中，mRNA的 5ʹ Cap可以对mRNA的转录后剪接、核输出、蛋白的翻译起始以及对抵御核酸外切酶的降解等多个方面进行调控，并且5ʹ Cap还可以为先天免疫系统去标记来源于机体自身的RNA，从而使这些RNA免于被攻击。真核生物的 5ʹ Cap是一个7-甲基鸟苷 (m7G)，它通过三磷酸桥连到第一个核苷酸上，所形成的结构被称作Cap 0。在细胞内，Cap 0 已经可以募集翻译起始因子并防止 mRNA 的降解。mRNA的第一个核苷酸的2ʹ-羟基会被甲基化，从而生成Cap 1。在约 50% 的转录产物中，mRNA第二个核苷酸的2ʹ-羟基也会被甲基化，从而形成Cap 2。另外，通常mRNA的第一个核苷酸是腺苷，并且这个腺苷的N6会被腺苷甲基转移酶（目前推测是与RNA 聚合酶 II相互作用的一个因子）甲基化，从而形成m 6 A m cap。因此，除了 cap 0之外，成熟的真核 mRNA至少还含有三种内源性帽结构：cap 1、cap 2 和 m 6 A m cap。哺乳动物免疫蛋白如 RIG-I 和 IFIT 可以识别异常加帽的 RNA，其中RIG-I 识别未加帽的 5ʹ-三磷酸 RNA 或 cap 0，然而RNA的cap 1 修饰则可以消除 RIG-I的信号传导。IFIT 蛋白可以识别缺乏 2ʹ-O-methylation（Cap 1）的RNA，并结合在它们的 5ʹ 末端，进而通过与翻译起始因子竞争结合RNA的方式来阻止病毒的翻译。因此在功能方面来说，cap 1 的结构可以将 mRNA 标记为“自身 RNA”。cap 0 RNAs 相对于cap 1 RNAs 只显示出很小的体内活性，另外，约有50% mRNA 具有 cap 2 结构，约有30-40% mRNA 具有m 6 A m cap结构，目前cap 2 的功能仍不清楚，m 6 A m cap可能可以利用专门的翻译起始因子来增强蛋白翻译。

几种5’ Cap 的结构

目前主要有两种方法可以在体外产生加帽的RNA：

第一种方法是在转录后使用牛痘病毒加帽酶对 RNA 进行加帽，从而产生带有 Cap 0 或 Cap 1 的RNA。之所以会产生Cap 0 或Cap 1，这是因为 ①加帽酶有鸟苷转移酶活性，可以将底物中的m7G帽子加到RNA的5′-三磷酸末端，产生Cap 0； ②加帽酶有甲基转移酶活性，可以将底物SMA中的甲基，转移到起始核苷酸的 2'-O 位置，产生Cap 1。加帽反应非常高效，但它在扩大生产规模的过程中，会额外添加2'-O-Methyltransferase以增加 Cap1的加帽率，因此整个体系会更昂贵也更加复杂。并且通过酶促反应是不能产生Cap 2 或者m 6 A m cap的。

利用牛痘病毒加帽酶对 RNA 进行加帽

第二种方法是通过在转录过程中，加入过量的Cap类似物来进行加帽。① 传统的Cap类似物包括GpppG和 m7GpppG 等。在体外转录的起始过程中，噬菌体的RNA 聚合酶通过m 7 GpppG 中鸟苷的3'-OH对DNA模板编码的下一个NTP的α-磷酸进行亲核攻击来启动转录。但是，这种亲核攻击也有可能由m 7 GpppG的3'-OH发生，即第二个核苷酸连接到了帽子鸟苷的3'位置，从而致使只有50%的转录产物有正确的帽子（正确的加帽是m 7 GpppGpNpN ，错误的加帽是Gppm 7 GpNpN… ）。这种反向加帽的转录物直接降低了50%的 mRNA 的整体翻译活性。② 因此在这个基础上，科研人员开发了抗反向帽类似物ARCA (anti-reverse cap analog)，ARCA是在 m 7 G 中引入带有 3'-O-甲基、3'-H 或 2'-O-甲基的修饰，从而确保了加帽后NTP连接的正确方向。通过ARCA加帽后可以形成 Cap 0，但是加帽的效率略低（70%加帽mRNA/30%三磷酸mRNA）并且加入ARCA的体外转录产量低（由于在体外转录中，为了避免GTP与ARCA竞争结合，因此使用的 GTP 浓度较低，从而降低了整个反应的产量，以致最终产量约为1.5 毫克mRNA/毫升转录产物）。③ 此外，在转录时使用CleanCap，也是目前十分常见的做法。ARCA是使用二聚体 (m 7 GpppG) 起始T7 启动子的转录，而CleanCap是使用三聚体 (m 7 GpppA m G) 启动（目前也有m 7 GpppA m U、m 7 GpppG m G等版本；对于ARCA来说，它可以在Cap 0 的2’ 3’位置进行修饰，从而使NTP无法反向插入。但是ARCA无法在第一位G的3’ 进行甲基化修饰-暨无法加入Cap 1，因为这会使NTP无法在3’位置正向插入。而CleanCap是三聚体的形式，它已经将Cap 0、Cap 1 整合在了一起，并且末位的G是未加修饰的，因此可以使NTP在G的3’位置正向插入）。由于 T7 RNA 聚合酶非常偏好以GTP 起始，因此酶促加帽或 ARCA 加帽的 RNA ，都会以 5ʹ-G开始。但 T7 聚合酶与CleanCap结合后，对起始的5ʹ 核苷酸的使用是无偏好的，因此它可以以各种核苷酸来起始序列的转录。这种方法产生高度加帽的 RNA，产量更高（转录约 4 毫克/毫升）。并且CleanCap 方法可以产生 cap 0、cap 1、cap 2 或m 6 A m加帽的 mRNA。

利用Cap类似物对 RNA 进行加帽

2. 新的核苷酸修饰方法

另一种可以提高 mRNA 稳定性和翻译效率的方法是对mRNA进行替代核苷酸修饰。其实在自然界中，很多RNA都发生了转录后修饰，尤其是tRNA ，可能大约有五分之一的核苷酸含有 RNA 修饰。目前已确定的RNA合成后修饰多达150多种，而在mRNA中常用的核苷酸修饰策略是在体外合成mRNA时，利用假尿苷 (Ψ)、1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 和 5-甲基胞苷 (m5C) 替代天然尿苷和胞苷来进行转录反应。利用修饰核苷的优势主要体现在以下几个方面：①当单链 mRNA 分子被外源性递送至细胞时，他会被细胞本身判定为Pathogen-associated molecular pattern。单链 mRNA及其降解产物会被Toll 样受体 7 (TLR7) TLR3和 TLR8 识别，从而激活先天免疫系统的细胞，产生高水平的TNF-α和 IFN-α。而利用假尿苷等替代天然的尿苷，则可以避免这一点。假尿苷是 RNA 中最常见的修饰，并且哺乳动物存在假尿苷修饰的 mRNA 代谢和随后排入尿液的自然途径，因此这可能是假尿苷具有较低免疫原性的原因。②假尿苷修饰后的mRNA稳定性有所增加，从而可以起到增强翻译的效果。有文献报道过，当mRNA的尿苷被假尿苷取代时，它对磷酸二酯酶的水解具有更高的抵抗力。并且假尿苷可以通过促进碱基堆积来稳定 mRNA的二级结构，从而减缓在体内的降解。

对mRNA的核苷修饰可以降低其免疫原性、增加稳定性与翻译效率

3. 对mRNA分子的其他优化

效载荷来增强。mRNA的表达盒由多个元件组成，包括 5' 非翻译区 (5' UTR)、蛋白质编码区、3' UTR 和多聚腺苷酸化 (PolyA) 信号。

①对UTR区域的优化。在 mRNA 的非翻译区 (UTR) 内存在多个调控元件，这对于 mRNA 的稳定性和蛋白翻译的效率都非常重要。譬如有的5' UTR 上的RNA 元件可能会改变其二级结构（例如，内部核糖体进入位点 [IRES]、上游起始密码子[uAUG] 或上游开放阅读框 [uORF]），从而影响核糖体在起始密码子附近与mRNA的结合，进而发挥调节翻译效率的作用。3' UTR则是mRNA 分子的细胞内动力学的关键调节因子之一，它在长度上会有一个最优范围，具有较长 3' UTR 的 mRNA的半衰期较短，而具有较短 3' UTR 的 mRNA 翻译效率则较低。目前科研人员对 UTR 序列与相关蛋白质表达水平之间关系的了解有限，因此很难做到对UTR 的从头设计，所使用的也往往是天然的UTR。譬如说 β-珠蛋白的5'-和 3'-UTR 可以明显提高翻译效率， α-珠蛋白的 3'-UTR则可以稳定mRNA，非洲爪蟾 β-珠蛋白 5'- 和 3'- UTR 、TEV的5'-UTR和人热休克蛋白 70 的 5'-UTR等同样被发现可以提高mRNA 的翻译效率。目前mRNA 治疗中常用的 3' UTR 多来源于 α 和 β 珠蛋白，这是红细胞中最丰富的蛋白质，它在细胞中可以增加 mRNA 半衰期的能力已经得到了多次的验证。另外通过算机遗传算法，对海量的UTR进行机器学习从而构建新的合成型UTR或将几个UTR组件相互组合已达到更好的效果，也是目前很有前景的方向。

mRNA的5’ 3’ UTR区域

②对mRNA的蛋白质编码区进行序列优化，同样是一个重要的步骤。蛋白质编码区的序列，不但会影响翻译效率、蛋白质折叠还同样会影响 mRNA 的丰度。因此在进行序列优化时需要考量多个参数，例如序列中的GC含量。尽管富含 GC 的序列可能对 mRNA 的二级结构形成产生影响，但富含 GC 的序列的翻译效率可以比富含AT的序列的翻译效率高 100 倍；另外翻译延伸率的高低取决于密码子相应 tRNA 的可用性，因此避免使用稀有密码子是密码子优化的主要内容；此外，密码子优化对于 mRNA 稳定性也同样十分重要，因为由密码子决定的翻译延伸率，是影响mRNA稳定性的主要因素。有文章显示，使用稀有密码子会降低 mRNA 的翻译延伸效率，进而会导致募集 DEAD-box RNA 解旋酶 Dhh1p，从而触发 mRNA的降解。目前还有一些实验室利用生物信息学方法，对mRNA的序列进行深度学习，从而设计方法在不影响氨基酸序列的情况下，优化mRNA序列，并增强其稳定性。例如Hannah等人将 RNA 分子的降解率与RNA碱基未配对概率 (AUP) 的平均值联系起来，他们发现如果AUP 减少 2 倍则会使 mRNA的半衰期增加 2 倍。因此重新设计 RNA 序列以形成双链区域，以改变二级结构的方式来减少mRNA降解，也会是mRNA优化的重要策略。

③对mRNA进行poly(A) 加尾。poly(A) 尾是大多数成熟哺乳动物 mRNA 的 3' 末端的一段腺苷酸残基。哺乳动物成熟mRNA 的 poly(A) 尾由几十个到300个腺苷残基组成，它可以与多聚（A）结合蛋白 (PABPs) 形成细胞质核糖核蛋白 (RNP) 复合物。这种相互作用对于高效翻译和控制 mRNA 稳定性是非常必要的。当mRNA 到达细胞质，poly(A) 尾核糖核蛋白复合物与 5' 帽协同作用，可以和 eIF4F 复合物形成稳定的闭环结构，从而促进翻译起始。因此，poly(A) 尾的存在对于有效的蛋白质表达是必不可少的。另外，poly(A) 还可以通过防止外切酶降解来稳定 mRNA 分子。因此，去腺苷酸化率在很大程度上决定了 mRNA 的半衰期。将细胞质中的 poly(A) 尾缩短至小于 15–20 nt 会破坏poly(A)与最后一个 PABP 的相互作用。一旦最后一个 PABP 被释放，mRNA 就会变得不具有翻译活性并且易于降解。

poly (A)尾巴与蛋白翻译的起始

对于体外转录的 mRNA，poly(A) 尾可以编码到 DNA 模板（既可以是PCR 产物，也可以是质粒）中，也可以在体外转录后通过酶促反应添加到 mRNA 中。虽然 PCR 提供了很大的灵活性并可以广泛用于小规模 mRNA 生产（几百毫克）中，但高生产成本和 PCR 扩增过程中的突变风险限制了其在大规模生产中的应用（几克）。另一方面，目前质粒的生产工艺已经非常成熟，与基于 PCR 的模板制备方法相比，质粒制备具有较低的生产成本和较低突变风险。然而，poly(A)片段在质粒DNA在细菌内的扩增过程中容易发生重组，进而产生序列缺失的突变体。虽然模板编码poly(A) 尾的方法有以上的不足，但在工业上也要比酶促价位方法更有优势，例如模板编码可以产生确定且可重复的 poly(A) 长度，从而保证了产物的一致性。而酶促反应生成的poly(A) 长度不同，最终产品的组成难以控制，因此可能不符合监管要求。目前，在工业生产mRNA疫苗的poly(A) 尾有几种不同的形式。例如使用长度为 101 nt 的 poly(A) 尾，120 nt 的poly(A) 尾或者分段式的120 nt poly(A) 尾等等。

当然，本章节还应该有一个重要的内容就是新的mRNA递送载体，这也是让mRNA疫苗大出风头的最关键因素。不过相信大家已经看到了好多的关于mRNA递送载体设计、专利纷争的文章，因此小编在这里就不一一赘述了。小编在参考资料中提供了两篇吃瓜文章，欢迎大家品尝。下一篇（中篇）小编将针就mRNA疫苗在体内的免疫学作用展开深入讨论，尽请关注。

参考资料：

mRNA的5’ Cap：

https://www.genengnews.com/insights/rna-epitranscriptome-role-of-the-5-cap/

https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2935-4/figures/4

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/science.aav0080

https://www.jenabioscience.com/nucleotides-nucleosides/nucleotides-by-structure/analogs-and-derivatives-of/cap

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15384101.2018.1486164

mRNA的核苷酸修饰：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168365915300948

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616326818

https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2818%2930849-3

mRNA的UTRs：