广工大安太成教授团队WR: 典型防腐剂转化机制及其健康毒理方面的影响

近日，广东工业大学环境健康与污染控制研究院，环境科学与工程学院安太成教授和高艳蓬副教授等在典型防腐剂光降解过程中的环境健康研究方面取得新进展，研究成果以Unexpected culprit of increased estrogenic effects: Oligomers in the photodegradation of preservative ethylparaben in water为题发表在国际水质学会会刊《Water Research》杂志上。该研究以防腐剂对羟基苯甲酸乙酯（EP）为例，探讨其在UV光降解过程中雌激素效应增加的本质原因，结果表明低聚物是导致雌激素效应增加的主要元凶，而并非我们通常原以为的羟基加合物。研究结果提供了羟基加合物雌激素活性的新认识，改变了传统的认识。同时也为阐明EP光降解与光催化过程中不同的雌激素效应变化提供了有力证据。我们呼吁水体中新兴有机物光降解产物及其环境健康效应亟需引起重视。

第一作者：高艳蓬副教授

通讯作者：安太成教授

通讯单位：广东工业大学

论文DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.115745

图文摘要

引言

水体中新兴有机污染物（EOCs）的环境转化与健康效应引起了人们的普遍关注。近期的研究发现EOCs光降解过程中出现毒性增加的现象，即使在水处理过程中原型EOCs的浓度低于检出限，其毒性效应并没有降低。因此探明EOCs光降解过程中毒性增加的本质原因至关重要。对羟基苯甲酸酯作为一类重要的EOCs，在一个多世纪以来，被用作防腐剂广泛添加于食品，化妆品和药品中等。据估计，全球每年对羟基苯甲酸酯的消费量高达8000吨。随着广泛而频繁的使用，在各种水生环境介质、甚至是人体样本中普遍检出对羟基苯甲酸酯。相关毒理学研究表明对羟基苯甲酸酯具有潜在的雌激素活性，可能与乳腺癌的发病率有关。我们课题组前期研究发现，对羟基苯甲酸酯光降解过程中雌激素效应先增加后降低（Water Res. 2016, 91: 77-85；Environ. Toxicol. Chem., 2014, 2014, 1809–1816），但光催化过程中雌激素效应却逐渐降低（Water Res. 2016,91: 77-85；Environ. Sci. Technol. 2013, 47: 2704-2712；J. Hazard. Mater. 2014, 278, 417-425）。因此，本文以对羟基苯甲酸乙酯（EP）为例，使用重组人雌激素受体基因酵母-雌激素测定法检测光降解过程中雌激素效应的变化，并采用HPLC-TOF-MS等分析手段重点甄别并鉴定雌激素效应增加过程中的转化产物。同时借助理论计算、闪光光解实验、电子顺磁共振实验等阐明EP光降解产物的形成途径和降解机理。

图文导读

首先，本论文研究了1000 W高压汞灯下500μM EP的降解情况（如图1），在仅有可见光的照射下，反应进行90分钟只有10%的EP降解。然而在紫外光照射40分钟时，EP降解效率达到50%，约90分钟内完全降解，矿化率仅为20%。

图1. EP的光降解动力学

图2. EP降解过程中雌激素效应变化

为了测定EP光降解过程中雌激素效应的变化，我们采用重组人雌激素受体基因酵母的方法进行评估（如图2）。EP光降解溶液的雌激素效应随着反应的进行出现先升高后降低的趋势，尤其降解到40分钟时的雌激素效应达到最高。那么到底形成了哪些光降解产物具有比原始化合物EP更高的雌激素活性？通常认为，苯环上的羟基加合物可能会增加原始有机污染物的雌激素活性。先前已有报道，苯环酚羟基在17β-雌二醇的光催化降解过程中并未被破坏，相应溶液中仍存在雌激素作用。在紫外照射下，雌酮的光降解溶液中雌激素效应变高是由于其光解产物，单羟基以及多羟基化产物。因此，OH-加合物产物被认为是雌激素活性增加的最可能的原因。 

图3 EP以及3-OH-EP的雌激素效应曲线

在EP的光降解过程中，通过HPLC-TOF-MS检测到一种物质，通过分析并且与标准物质的对照，拥有同样的保留时间以及离子碎片的物质为3,4-二羟基苯甲酸乙酯（简称3-OH-EP）。但是，在EP的光降解过程中，降解溶液中雌激素效应的变化与3-OH-EP峰面积的变化不一致（图2）。3-OH-EP的峰面积在20分钟内不断增加，20分钟时达到最大值，此时和原始雌激素效应相比略有降低。40分钟时，3-OH-EP进一步分解并几乎完全耗尽（<12％）。而降解溶液表现出最大的雌激素效应。以上数据表明，在EP的光降解过程中，羟基加合物3-OH-EP的生成与雌激素效应的增加没有关系。为了再次确认羟基加合物3-OH-EP的雌激素活性，分别测定了两者的雌激素效应曲线（图3）。实验结果表明，3-OH-EP的EC₅₀值为2.32×10^-4M，比EP（1.35×10^-5M）高一个数量级。这表明了羟基加合物3-OH-EP的雌激素效应低于母体化合物的雌激素效应，进一步证实羟基加合物3-OH-EP不是雌激素效应增加的原因。

图4  Pre-HPLC分离EP降解40分钟溶液的色谱图以及HPLC-TOF-MS分析得到的主要产物

为了继续探究EP在光解过程中雌激素效应增加的直接原因，光降解过程中产物的鉴定尤为重要，尤其是降解40分钟时的产物组成。Pre-HPLC分离EP降解40分钟的溶液得到的色谱图中（图4），主要由4个色谱峰构成，保留时间分别为10.6、32.0、34.9和53.3分钟，经过HPLC-TOF-MS的分析鉴定，保留时间为34.9分钟的峰，是原始化合物EP。保留时间为10.6分钟的峰为转化产物A，经过标准物质的对照，A物质被确定为对羟基苯甲酸（HB）。对羟基苯甲酸是一种没有雌激素效应的物质。因此，雌激素效应的增加与HB的生成没有关系。对于剩下的降解产物B（32.0分钟）和C（53.3分钟）进行了更彻底的研究。如图2所示，产物B和C的峰面积随着EP光降解的发生先增加然后不断下降，在40分钟时，两者是产物的主要组成部分。B和C的结构同样根据HPLC-TOF-MS分析的结果分析得到。产物B被确定为光反应过程中形成的低聚物4-羟基间苯二甲酸1-乙酯3-（4-羟基苯基）酯。产物C被确定为光反应过程中形成的二聚体4-羟基-3-[2-（4-羟基-苯氧基羰基）-乙基]-苯甲酸乙酯。从以上数据表明，B和C两种产物是导致雌激素效应增加的最大原因。此外，通过使用VirtualToxLab程序基于多维定量结构-活性关系，从理论上对产物的雌激素效应进行预测，计算得到产物B的雌激素活性（IC₅₀）为1.29µM，低于原始EP的雌激素效应，表明产物B的雌激素效应高于母体化合物的。 

图5  EP的瞬态吸收光谱，及其分别N₂和O₂饱和条件下的瞬态光谱

为了更好地了解EP光降解过程中毒性产物的形成机理，有必要评估降解过程中主要的活性物种。实验使用特定淬灭剂淬灭活性物种后观察降解速率的变化。不同淬灭剂作用下EP的降解动力学曲线发现，三重激发态在EP降解中起着主要的贡献作用。进而采用激光闪光光解研究发现，EP光降解过程中形成了两个分别位于320和640 nm处的吸收峰（图5左）。640 nm处为水合电子的出峰，而320 nm处瞬态物种的吸收峰随时间变化逐渐的增强，在N₂和O₂饱和条件下（图5右），EP的乙腈溶液中去观察320 nm出峰变化，当O₂存在时，^•EP-H和EP^•+不能产生，因此再次确认³EP*的形成，且其吸收峰位于320nm处。瞬态中间产物³EP*生成后在35 ns的短时间内增加，随后迅速衰减。为了进一步的探究转化机理，我们进行了量子化学计算。图6显示了所有可能的键裂解途径的反应能。计算结果表明，只有O-CH₂CH₃键的裂解过程是放热过程，ΔG为-5.86kcal / mol，而其他键裂解反应是吸热过程。因此，EP经光照首先形成主要活性物种³EP*，进而发生O-CH2CH3键断裂，最终形成转化产物。

图6  EP（3EP*）激发三重态的所有可能途径的反应能量（ΔG）

根据上述结果与转化产物的研究，提出了水中的EP光化学降解机理，如图7所示。EP的激发单重态（¹EP *）首先在EP辐射下形成，由于¹EP *的不稳定性，然后进一步转变为激发的三重态（³EP *）。此外，³EP *的转化主要是通过O-CH₂CH₃键的断裂而发生的，导致形成了羧基自由基的烷基化中间体。同时，在有氧环境中可以从O₂中生成¹O₂，并通过电子顺磁共振（EPR）确认了¹O₂的形成。转化产物3-OH-EP是通过EP与¹O₂的反应形成的，而不是通过与•OH的反应形成的。除具有非雌激素活性的HB形成外，羧基脱烷基的中间体还可能导致转化成光化学生成的低聚物B和C，从而使得水系统中EP的光化学转化过程中引起雌激素活性的增加。

图7 水中的EP光化学降解机理

结语

通过本研究可以了解水中EOCs的光化学转化对其人体健康的不利影响非常重要。因此，以典型的防腐剂EP为例，研究了水中光化学降解过程中雌激素活性的变化，结果表明雌激素活性随降解时间先增加后降低。有趣的是，发现预期的羟基加合物并不是导致EP光降解过程中雌激素增加的主要原因，其EC₅₀值比原始化合物EP高出1个数量级。该结果提供了关于羟基加合物的雌激素活性的新见解，改变了传统的认识。EP光化学降解过程中雌激素效应的增加是由于光化学转化产物——低聚物的形成所导致。该研究表明在未来的污染物研究和风险评估中，应更加关注降解产物与原始母体EOCs在水中的环境生态和人体健康影响。

作者介绍

高艳蓬，博士，副教授，硕士生导师。长期开展新兴有机污染物环境转化机理与环境健康等方面的实验与理论计算研究工作。研究成果在 Environ. Sci. Technol.、 Water Res、Environ. Int.和Appl.  Catal. B: Environ.等国内外环境科学与工程类权威期刊上发表学术论文39篇(其中SCI收录论文34篇)。主持/完成国家自然科学基金面上项目和青年科学基金项目、广东省自然科学基金、广州市科技计划项目等7项，作为核心成员参与国家自然科学基金重点项目、国家杰青项目、国家重点研发计划与广东省“珠江人才计划”本土创新科研团队等10余项。

个人主页：

高艳蓬副教授：http://yzw.gdut.edu.cn/info/1121/1791.htm

安太成教授：http://www.antaicheng-group.cn/people/teacher/an%20laoshi.html 

相关研究：

Yanpeng Gao, YuemengJi, Guiying Li, Taicheng An*, Theoretical investigation on the kinetics and mechanisms of hydroxyl radical-induced transformation of parabens and its consequences for toxicity: Influence of alkyl-chain length. Water Res. 2016, 91: 77-85.

Hansun Fang, Yanpeng Gao,Guiying Li, Jibin An, Po-kueng Wong, Fu Haiying, Side Yao, Xiangping Nie, Taicheng An*. Advanced Oxidation Kinetics and Mechanism of Preservative Propylparaben Degradation in Aqueous Suspension of TiO₂ and Risk Assessment of Its Degradation Products. Environ. Sci. Technol. 2013, 47: 2704-2712.

Yanpeng Gao, Hansun fang, Yuemeng Ji, Guiying Li, Taicheng An*, Computational consideration on advanced oxidation degradation of phenolic preservative, methylparaben, in water: mechanisms, kinetics, and toxicity assessments. J.Hazard. Mater. 2014, 278, 417-425.

Taicheng An*, Hansun Fang, Guiying Li, Shilong Wang, Side Yao. Experimental and theoretical insights into photochemical transformation kinetics and mechanisms of aqueous propylparaben as well as risk assessment of its degradation products. Environ. Toxicol. Chem., 2014, 2014,1809–1816

供稿：安太成教授团队，仅供分享交流不作商业用途，版权归原作者。

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