哈工大任南琪院士团队谢国俊课题组、重庆大学陈一课题组合作ES&T封面：亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化细菌的生态位分化机制

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第一作者：聂文博

主要作者：陈  一

通讯作者：谢国俊

通讯单位：哈尔滨工业大学环境学院，城市水资源与水环境国家重点实验室

论文DOI：10.1021/acs.est.2c08094

封面图

成果简介

近日，哈工大任南琪院士团队谢国俊课题组与重庆大学陈一课题组合作在环境领域著名学术期刊Environmental Science & Technology上发表了题为“Microbial Niche Differentiation during Nitrite-Dependent Anaerobic Methane Oxidation”的封面论文。亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化（n-DAMO）已被证明在全球甲烷和氮循环中发挥重要作用。然而，尽管在环境中广泛检测到不同的n-DAMO细菌，但对其微生物生态位分化的生理机制知之甚少。该研究通过结合基因组学和动力学分析，在长期运行的生物膜反应器（MBfR）中观察到n-DAMO细菌的生态位分化现象。反应器MBfR-A和MBfR-B分别接种相同的n-DAMO富集培养物（培养物包含两种n-DAMO细菌：“Candidatus Methylomirabilis oxyfera”和“Candidatus Methylomirabilis sinica”），在低浓度NO₂^-进水条件下，MBfR-A反应器的n-DAMO细菌为“Candidatus M. oxyfera”，而以高浓度NO₂^-进水的MBfR-B的n-DAMO细菌为“Candidatus M. sinica”。转录组结果显示，“Candidatus M. oxyfera”在细胞趋化性、鞭毛组装和双组分系统具有更完整的功能，有助于其在寡营养条件下对NO₂^-的摄取；而“Candidatus M. sinica”具有更活跃的离子转运和胁迫响应系统，在NO₂^-还原方面具有更多的冗余功能，有助于缓解高浓度NO₂^-的抑制作用。“Candidatus M. oxyfera”和“Candidatus M. sinica”的NO₂^-半饱和常数（0.057 mM vs 0.334 mM NO₂^-）和底物抑制常数（0.932 mM vs 2.450 mM NO₂^-）响应组学结果推断的结论，证实n-DAMO细菌生态位分化机制，即细胞生化特性，特别是NO₂^-亲和性和抑制性共同决定了n-DAMO细菌的生态位分化。

引言

亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化（n-DAMO）过程，耦联甲烷厌氧氧化（AOM）与亚硝酸盐还原，由甲烷营养菌NC10门内的细菌（Methylomyrabilota）催化，被认为是淡水生态系统中重要的甲烷汇。n-DAMO细菌以NO₂^-为电子受体，通过NO歧化胞内产氧途径氧化甲烷，其广泛分布于淡水、海洋、泥炭地、稻田土壤等生态系统。此外，n-DAMO细菌有助于污水脱氮同步甲烷减排目标的实现，近年来备受关注。目前已报道参与n-DAMO过程的菌种有5种，其中“Candidatus M. oxyfera”和“Candidatus M. sinica”在自然环境中分布较广，控制CH₄和NO₂^-的循环过程。然而，在种水平上，哪种因子对特定n-DAMO细菌具有选择性，目前尚无明显共识。一般认为，微生物对环境因子的竞争会影响生态系统结构，进而影响生态功能。因此，在物种水平上阐明n-DAMO细菌生态位分化的驱动因素将有助于更好地理解微生物竞争的内在机制。此外，了解驱动物种富集的因素可大大提高物种活性，通过生态位分化筛选特定物种也有助于污水处理反应器启动和生物量保留的优化调控。

图文导读

该研究中甲烷基MBfR-A和MBfR-B接种相同的n-DAMO富集培养物（该培养物包含“Candidatus M. oxyfera”和“Candidatus M. sinica”），分别以含有低浓度和高浓度NO₂^-的人工合成废水作为进水。反应器运行过程中n-DAMO细菌为最优势菌种，MBfR-A反应器的细胞平均NO₂^-暴露浓度为2.24 mg NO₂^--N·L^-1，而MBfR-B为6.37 mg NO₂^--N·L^-1（图S5）；通过对n-DAMO细菌全长16S rRNA克隆与进化分析，发现MBfR-A的n-DAMO细菌仅有“Candidatus M. oxyfera”（图3，OTU_1＞98%），MBfR-B则相反，仅含有“Candidatus M. sinica”（图3，OTU_2＞99%）。由此推测不同的NO₂^-暴露浓度是诱导n-DAMO细菌生态位分化的环境因子，并提出细胞对NO₂^-亲和力和敏感性的差异性是导致其在种水平上出现生态位分化的假说。

图S5. 反应器出水NO₂^-浓度反映不同细胞暴露NO₂^-浓度。其中（a）在整个运行周期内MBfR-A和MBfR-B反应器暴露的NO₂^-浓度范围；（b）不同运行周期MBfR-A反应器暴露的NO₂^-浓度变化范围；（c）不同运行周期MBfR-B反应器暴露的NO₂^-浓度变化范围

图3. 基于克隆文库中NC10门细菌16S rRNA序列的系统发育树（a），及克隆文库分析中分别进水低/高亚硝酸盐浓度的MBfR-A/MBfR-B反应器中NC10门细菌克隆的相对OTU丰度（b）。图中，Inoculum代表接种n-DAMO污泥样品，L533和L750分别代表MBfR-A运行第533天和750天的生物膜样品，H581和H1030分别代表MBfR-B运行第581天和1030天的生物膜样品

为了验证上述假说，该研究对比了上述两个物种的MAG、特征功能基因pmoA（编码甲烷单加氧酶）和nod（编码一氧化氮歧化酶）及其在不同暴露NO₂^-浓度条件下基因表达谱的差异性。结果显示，两个MAGs在碳固定、无机离子转运和代谢、细胞运动、应激反应系统和信号转导机制方面存在显著差异（图4）。两个MAGs包含了所有与CBB循环的相关基因且表达活跃。不同的是：在“Ca. M. sinica”的基因组中发现了一个完整的丝氨酸循环碳固定途径，表明CBB循环在n-DAMO细菌中并不是一个保守的特征（图4a）。相比于“Ca.M. sinica”，“Ca. M. oxyfera”具有更完整的细胞趋化性和鞭毛组装系统（图4b），与细胞运动相关的基因表达均上调。此外，“Ca. M. oxyfera”在信号转导机制中具有更完整的功能。例如，基因glnG和glnL响应氮限制，其转录水平均高于“Ca. M. sinica”（图4b）因此，上述优势有助于“Ca. M. oxyfera”在寡营养环境中的底物摄取。

图4. “Candidatus M. oxyfera”（Bin 10）和“Candidatus M. sinica”（Bin 11）基因组特征示意图。（a）包括两个MAGs共享的核心功能基因。括号中的数字表示该MAG中包含的相关基因的数量，红色和蓝色数字分别表示与“Candidatus M. oxyfera”和“Candidatus M. sinica”相关的基因数；（b）两个MAGs中相关功能基因的表达谱，热图中数字用来衡量相关功能基因的转录水平，其表示log10转换后的FPKM值；从红到蓝表示两个MAGs中相关基因的FPKM值从低到高

相比于“Ca. M. oxyfera”，“Ca. M. sinica”在无机离子转运和应激响应系统的转录水平较高，例如：基因copAB和pcoCD表达显著上调，响应颗粒甲烷单加氧酶金属中心的铜转运体。此外，编码多糖输出蛋白的基因（例如wza和kpsM）处于高转录水平，暗示高浓度NO₂^-输入影响细胞EPS的分泌；基因groES、groEL和hsp20编码伴侣蛋白和应激反应蛋白，其高转录活性响应了细胞应对高浓度NO₂^-的保护机制。有趣的是，“Ca. M. sinica”的MAG包含更多的氮代谢基因，其中基因norB和norZ（编码NO还原酶）的转录上调超过2倍，表明“Ca.M. sinica”在NO还原途径中具有更完整的功能；而基因hao（编码羟胺氧化酶）在“Ca. M. sinica”的MAG中也处于低转录水平，推测可能响应胞内NO的积累（与高浓度NO₂^-输入有关）（图4b）。总之，上述结果证实不同NO₂^-输入诱导n-DAMO细菌在物种水平上的生态位分化与微生物自身代谢特性密切相关。基于此，提出“Ca.M. sinica”为K-策略者，有利于竞争能力的增加；而“Ca. M. oxyfera”更倾向于“机会主义者”，属于r-策略者有利于增大内禀增长率。为了进一步验证结论，该研究结合动力学手段，测定了两种n-DAMO细菌活性对不同NO₂^-浓度的响应规律，该规律可用Haldane模型描述（图5）。通过该模型可以得出不同n-DAMO细菌在NO₂^-底物亲和性和NO₂^-底物抑制性上具有显著的数量级差别，在代谢动力学角度阐述了n-DAMO细菌生态位分化机制。

图5. 两种n-DAMO细菌在不同亚硝酸盐浓度下的比活性。其中（a）表示“Candidatus M. oxyfera”的动力学过程；（b）表示“Candidatus M. sinica”的动力学过程；图中显示了三个生物重复的数据。红色曲线表示Haldane模型拟合曲线；在所有测试中，初始溶解性甲烷浓度均为1.09 mM CH₄

由于自然环境或者WWTPs中NO₂^-的浓度取决于（短程）硝化和（短程）反硝化微生物的相对活性，其浓度通常可能从ng L^-1到mg L^-1不等，由此可推测NO₂^-的可用性也是n-DAMO细菌与其他厌氧微生物（如Anammox细菌）生态位分化的驱动因素。例如，“Candidatus Brocadia”和“Candidatus Kuenenia”的表观亚硝酸盐亲和系数（K_m(app)）为0.2-3.0μM，其1/K_m(app)远高于n-DAMO细菌，表明在NO₂^-和NH₄⁺共存的环境中，Anammox细菌将处于竞争优势。而n-DAMO细菌由于其更高的溶解性甲烷亲和性（相比于ANMEs），被认为是重要的甲烷汇。然而，如果人为活动导致自然生态系统中NH₄⁺过剩，Anammox细菌的生长仅受限于NO₂^-，这将会影响n-DAMO细菌的生态位分布，进而影响AOM过程。尤其是在强调反硝化型厌氧甲烷氧化耦合Anammox过程应用于污水脱氮同步甲烷控排的工艺中，氨的可用性将是一个关键参数协调微生物之间的竞争作用，也意味着WWTPs必须在NH₄⁺限制条件下运行，以防止Anammox细菌对n-DAMO细菌的过渡竞争。因此，了解n-DAMO细菌的生理生态学，特别是其生态位分化机制，有助于在不同工艺和需求条件下的功能微生物选择。

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小结

综上所述，该研究结合组学和动力学分析，更好地揭示了驱动n-DAMO细菌在物种水平上生态位分化的因素，同时也强调了n-DAMO细菌生理特性差异的内在机制，将有助于我们全面理解其作为重要甲烷汇的细胞生态学和微生物进化学。未来的研究工作应进一步考虑不同NO₂^-输入可能导致n-DAMO细菌的差异表型遗传现象。在与其共生的厌氧甲烷氧化古菌“Candidatus Methanoperedens nitroreducens”培养物中已观察到具有基因相同细胞表型变异的复杂生命周期。“Candidatus M. nitroreducens”培养物中的部分细胞在不同环境中能够向更有利的条件趋化，这是否意味着还存在一些环境因素驱动微生物在种水平上出现生态位分化尚不清楚。事实上，“Ca. M. oxyfera”和“Ca. M. sinica”也具有不同的细胞形态。因此，n-DAMO细菌是否也具有决定其生态位差异的多形性生命周期应需做深入的研究。此外，在解释微生物基因表达和生态系统模型时，应考虑细胞的表型变异。如果表型变异共性于自然环境中大多数具有生态位分化的微生物，那么微生物功能多样性的定义必须扩展到基因组之外。

本研究课题得到了国家科学基金委和中国博士后科学基金会的资助。

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通讯作者简介

通讯作者：谢国俊，哈尔滨工业大学环境学院教授、博士生导师，主要从事污水处理与资源化、厌氧甲烷氧化与利用、微生物驱动碳氮硫循环等方面的研究，主持国家自然基金面上项目、国家自然基金青年项目、国家重点研发计划子课题、昆士兰大学博士后基金等多项课题，获得霍英东教育基金会高等院校青年教师基金、微生物生态青年科技创新奖（优秀奖）。申请人共发表SCI收录论文70余篇，H因子26；其中第一或通信作者论文38篇，包括Environmental Science & Technology 7篇、Water Research 3篇；授权专利8项，被邀请为国际SCI期刊BioMed Research International、Water Science and Technology特约编辑。

邮箱：[e-mail]

第一作者：聂文博，重庆大学环境与生态学院弘深青年教师，博士后。目前在陈一教授团队开展湿地甲烷源与汇的研究。

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文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.est.2c08094

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