eLife︱许均瑜/王紫壹/夏军/罗建红首次揭示微管解聚蛋白KIF2C调控神经元微管动态稳定性及影响小鼠认知行为的机制

撰文︱杜永兰，郑芮

责编︱王思珍

微管（microtubule，MTs）是由微管亚基蛋白（tubulin）重复堆叠组成的细胞骨架聚合物，在真核细胞中普遍存在表达。在神经系统中，微管参与神经元分化，是胞内物质转运重要的结构基础。微管存在动态稳定性，该特性不仅有利于微管快速重组更有效地完成物质转运[1]，同时微管还可以参与神经元突触结构发育和可塑性等功能，记忆形成和维持也会受到动态微管变化的影响[1-4]。近年来的研究表明，微管动态稳定性在脑功能和疾病中发挥重要作用，在许多神经退行性疾病如阿尔兹海默症，帕金森等病症研究中观察到微管动态稳定性出现异常的现象[5]。研究微管动态稳定性的机制可以为治疗相关疾病提供新的干预途径以及潜在的药物靶点，然而目前对于调节动态微管具体的功能机制研究尚不明确。

2022年2月9日，浙江大学脑科学与脑医学学院的许均瑜团队在eLife杂志在线发表了研究论文“KIF2C regulates synaptic plasticity and cognition in mice through dynamic microtubule depolymerization”。 研究人员首次在神经系统中探究有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（mitotic centromere-associated kinesin, MCAK/KIF2C）在神经系统中的功能，发现KIF2C的微管解聚功能对于神经元突触传递和可塑性以及小鼠记忆认知缺陷的调控作用。在此项研究中，研究人员发现KIF2C富集在突触后致密区，稳定表达于神经元发育及成熟阶段且广泛分布在小鼠各个脑区。KIF2C通过发挥解聚微管的功能调节神经元微管动力学，介导微管的突触侵入和AMAP受体膜表达，从而影响突触可塑性和学习记忆。该文首次在神经系统中发现KIF2C的微管解聚功能对于神经元突触传递和可塑性以及小鼠记忆认知缺陷的调控作用。

以往的研究表明KIF2C能够通过在微管末端消耗ATP水解产生的能量，改变微管蛋白结合构象促进微管解聚从而影响微管动态稳定性[6-8]。因此KIF2C可参与许多微管依赖性事件，包括有丝分裂，纤毛形成等。目前对于KIF2C的功能研究主要体现在有丝分裂细胞中，其在中枢神经系统中的功能尚未发现。根据研究人员以往预实验结果发现KIF2C很有可能存在于神经系统且参与突触相关功能，因此研究人员决定系统地对KIF2C开展研究。

研究人员首先利用海马神经元原代细胞培养、免疫蛋白印迹和免疫荧光染色等技术检测KIF2C在神经系统中的表达和定位，结果发现KIF2C稳定表达于神经元发育及成熟阶段且广泛分布在小鼠各个脑区。通过对小鼠海马组织组分分离提取显示KIF2C富集存在于突触后致密区，这一结果暗示KIF2C在突触中存在功能的可能性（图1）。

图1 KIF2C在中枢神经系统中的表达

（图源：Zheng Rui, et al., eLife, 2022）

紧接着，研究人员构建kif2c^flox/flox;Nestin^Cre （cKO）小鼠条件性敲除神经元中KIF2C蛋白表达水平，通过高尔基染色和透射电镜观察到，KIF2C表达异常导致海马CA1神经元的树突棘类型发生改变，其中mushroom型（成熟型）突触分布密度显著下降而filopodia型（非成熟型）显著增多。通过冷冻透射电镜对CA1神经元突触后致密区观察发现KIF2C缺失导致突触后致密区厚度和长度显著减少。以上结果提示KIF2C参与神经元突触发育（图2）。

图2 KIF2C敲除小鼠海马突触结构异常

（图源：Zheng Rui, et al.,eLife,2022）

研究人员通过电生理手段检测了KIF2C缺失对神经元突触传递和突触可塑性的调控作用。结果显示KIF2C表达量降低（KIF2C shRNA）或缺失（KIF2C cKO）均会导致微兴奋性突触电流（mEPSCs）幅值增加、长时程增强（LTP）诱导维持出现缺陷、膜上离子型谷氨酸受体α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）表达量增加。同时在化学刺激模拟神经元兴奋性增强过程中，研究人员意外发现KIF2C在树突棘中出现活性依赖性的位移改变。以上发现首次揭示了KIF2C在神经系统中的分布以及在突触功能维持中的重要作用（图3）。

图3 KIF2C敲除影响突触传递和可塑性

（图源：Zheng Rui, et al., eLife, 2022）

然而，KIF2C是否是通过对动态微管的调控从而发挥功能的呢？研究人员首先通过活细胞成像分析发现cKO海马神经元内微管动力学出现异常，通过标记新聚合的微管观察到神经元兴奋性增强时，与对照组相比微管运动进入到树突棘中的事件概率减少。为了进一步验证KIF2C的功能，研究人员分别构建了KIF2C（WT）和KIF2C解聚功能缺失的突变体KIF2C（G491A）进行补偿实验，结果显示，KIF2C（WT）能够恢复异常的突触传递和突触可塑性，而KIF2C（G491A）不能。说明KIF2C通过发挥解聚微管的功能调节神经元微管动力学，从而参与突触功能（图4）。

图4 MT动态异常导致突触传递和可塑性变化

（图源：Zheng Rui, et al., eLife, 2022）

为了探究KIF2C缺失导致的突触发育和功能异常是否会损伤高级脑功能，研究人员通过多种行为学范式检测了神经元缺失KIF2C对于小鼠行为的影响。结果发现，敲除KIF2C导致小鼠认知学习行为障碍。在cKO小鼠海马神经元中重新导入KIF2C（WT）和突变体KIF2C（G491A），发现重新表达KIF2C（WT）的小鼠行为可以得到修复，而表达KIF2C（G491A）的小鼠依旧存在行为障碍。综上，研究人员在神经系统中首次发现KIF2C的微管解聚功能对于神经元突触传递和可塑性以及小鼠记忆认知缺陷的调控作用（图5）。

图5 KIF2C敲除导致记忆受损

（图源：Zheng Rui, et al., eLife, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究结合免疫印迹、膜片钳电生理等技术，揭示微管解聚驱动蛋白 KIF2C/MCAK 在海马神经元功能、突触传递、可塑性中起着重要作用。研究者发现KIF2C急性敲低或敲除都使LTP表达和维持受损，miniEPSC的幅值增大，提示KIF2C在调节海马神经元突触传递和可塑性中占有重要作用。研究者通过生化检测发现表面AMPA受体的表达量增加，结合电生理结果，研究者推测突触上离子型谷氨酸受体，尤其是AMPA受体的表达增加可能导致LTP表达受损。研究者利用KIF2C cKO海马神经元的活细胞成像观察了MT动力学，发现KIF2C的缺失会导致树突MT更快地生长。同时KIF2C缺失也增加了基础条件下MT入侵的频率，研究者推测这可能是由于MT聚合抑制能力缺失导致的。MTs还负责细胞内运输，KIF家族的其它成员可以转运NMDA受体[9]和AMPA受体[10]，以往研究表明MT动态稳定性调节AMPA受体的突触后定位和突触可塑性[11, 12]。研究者推测KIF2C可能通过调节MT稳定性来调节膜受体运输。

该研究首次发现KIF2C在神经系统的重要功能，通过对其作用机理的挖掘，发现细胞微管依赖于神经活动调控突触受体转运及突触可塑性，从而进一步参与大脑的高级认知过程。研究对神经系统中微管动态如何参与调控神经功能的机制有了更新的了解。在论文中，作者提出KIF2C调控微管动态可能是经由微管的突触侵入这一途径，在研究中也提供了证据显示KIF2C可以神经活动依赖性调控微管的突触侵入过程。然而，该研究尚未进一步分辨其在树突和突触内的功能差异及后果，课题组表示未来将继续着力于阐明突触内微管动态的调节机制。

原文链接：: https://doi.org/10.7554/eLife.72483

许均瑜副教授（左），主要通讯作者；郑芮博士（中），共同第一作者；杜永兰博士（右），共同第一作者。

（照片提供自许均瑜课题组）

浙江大学脑科学与脑医学学院博士生郑芮和博士生杜永兰为本文共同第一作者。浙江大学脑科学与脑医学学院许均瑜副教授、浙江大学基础医学创新研究院王紫壹博士、香港科技大学夏军教授、以及浙江大学脑科学与脑医学学院罗建红教授为本文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金（31970902, 3192010300, 32000692, 31871418, 81821091），浙江省自然科学基金（LD19H090002, LR19H090001），广东省重点领域研发计划（2019B030335001）和香港研究资助局（16103520）的支持。许均瑜团队致力于突触形成和成熟的分子机制研究，及其在孤独症中的病理机制。在Nature Neuroscience、Neuron、Journal of Neuroscience等杂志发表多篇论文。课题组诚聘博士后及科研助理，欢迎联系！

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1.Mitchison, T. and M. Kirschner, Dynamic instability of microtubule growth. Nature, 1984. 312(5991): p. 237-42.

2.Hu, X., et al., Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci, 2008. 28(49): p. 13094-105.

3.Gu, J., B.L. Firestein, and J.Q. Zheng, Microtubules in dendritic spine development. J Neurosci, 2008. 28(46): p. 12120-4.

4.Jaworski, J., et al., Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron, 2009. 61(1): p. 85-100.

5.Brunden, K.R., et al., Microtubule-stabilizing agents as potential therapeutics for neurodegenerative disease. Bioorg Med Chem, 2014. 22(18): p. 5040-9.

6.Wang, W., et al., New Insights into the Coupling between Microtubule Depolymerization and ATP Hydrolysis by Kinesin-13 Protein Kif2C. J Biol Chem, 2015. 290(30): p. 18721-31.

7.Moore, A.T., et al., MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol, 2005. 169(3): p. 391-7.

8.Lee, T., et al., MCAK associates with EB1. Oncogene, 2008. 27(17): p. 2494-500.

9.Setou, M., et al., Kinesin superfamily motor protein KIF17 and mLin-10 in NMDA receptor-containing vesicle transport. Science, 2000. 288(5472): p. 1796-802.

10.Setou, M., et al., Glutamate-receptor-interacting protein GRIP1 directly steers kinesin to dendrites. Nature, 2002. 417(6884): p. 83-7.

11.Hoerndli, F.J., et al., Kinesin-1 regulates synaptic strength by mediating the delivery, removal, and redistribution of AMPA receptors. Neuron, 2013. 80(6): p. 1421-37.

12.Heisler, F.F., et al., GRIP1 interlinks N-cadherin and AMPA receptors at vesicles to promote combined cargo transport into dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(13): p. 5030-5.

制版︱王思珍

本文完