eLife︱ɑ-突触核蛋白的突触定位对基底外侧杏仁核病理性谷氨酸能突触传递起决定性作用
撰文︱陈利强
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
ɑ-突触核蛋白（ɑ-synuclein，ɑSyn）是一种主要表达在突触前轴突末端的可溶性蛋白，可通过与突触蛋白和突触前膜相互作用调节囊泡的动态平衡[1, 2]。研究表明，ɑSyn的异常聚集构成帕金森氏症（Parkinson’s disease，PD）中常见的路易氏小体（Lewy body）的主要蛋白质成分[3]。越来越多的证据表明ɑSyn病变可在脑区之间传播，从而促进中脑多巴胺能神经元的死亡及PD的发生[4, 5]。
基底杏仁核（Basolateral amygdala，BLA）是大脑边缘系统的一部分，主要参与人类情绪的调节[6]。有证据显示在PD病人中，杏仁核与皮层之间的联系受损，导致错误的情绪信息编码或情绪与行为之间的错配[7, 8]。此外，大量研究表明异常路易氏小体聚集对杏仁核神经元具有选择性的毒性作用[9]。因此，研究者们认为其他脑区与杏仁核之间的功能联系受损可能是PD病人出现情绪困扰的原因。然而，ɑSyn的正常功能以及它的异常聚集物如何损害杏仁核环路功能仍然知之甚少。
2022年7月1日，美国文安德研究所（Van Andel Institute）的褚宏远团队在eLife上发表了题为“Synaptic location is a determinant of the detrimental effects of α-synuclein pathology to glutamatergic transmission in the basolateral amygdala”的文章，阐述了ɑSyn在杏仁核不同类型突触中的表达情况，证明了ɑSyn特异性表达在囊泡谷氨酸转运蛋白1阳性的（vesicular glutamate transporter 1-expressing，vGluT1+）皮层轴突末梢中，且ɑSyn异常聚集物特异性地损害了皮层到杏仁核的谷氨酸能突触传递。
大量研究结论显示，PD患者的杏仁核脑区对来自皮层和丘脑的刺激的反应出现了一定的障碍[7, 8]。因此，利用野生型小鼠，研究者们首先检测了ɑSyn在vGluT1+（主要来自皮层）和vGluT2+（主要来自丘脑）的轴突末梢中的表达情况。结果显示，在杏仁核、大脑皮层和纹状体中，ɑSyn信号主要与vGluT1+信号共标，而基本不与vGluT2+共标（图1）。此外，研究者们还利用SncaNLS/NLS报告小鼠进一步检测了ɑSyn在皮层和丘脑中的表达情况。SncaNLS/NLS报告小鼠使得研究者们可以直接观察内源性ɑSyn在大脑中的分布情况，避免了免疫荧光实验中ɑSyn免疫反应的不特异性（图2A）。同样的，研究者们发现ɑSyn大量表达在皮层第四和第五层的神经元中，而在丘脑中仅有少量或没有表达（图2B-D）。这些结果提示ɑSyn主要表达在vGluT1+的大脑皮层神经元及其轴突末端，但在vGluT2+丘脑神经元及其轴突末端不存在或表达极低。
图1 αSyn选择性的定位于小鼠脑囊泡GluT1+轴突末梢
（图源：Chen L, et al., eLife, 2022）
图2 内源性αSyn在脑皮质神经元中的表达水平高于丘脑神经元
（图源：Chen L, et al., eLife, 2022）
由于内源性ɑSyn的表达水平是能否形成ɑSyn聚集物的决定因素，研究者们推测vGluT1+神经元及其末端比vGluT2+更容易受到ɑSyn病变的影响。为了验证这一推测，研究者们利用了ɑSyn预制纤维（preformed fibrils, PFFs）模型在小鼠脑内诱发内源性ɑSyn的异常聚集。造模后一个月，可以在多个皮层脑区以及BLA中观察到大量的ɑSyn异常聚集（图3A-C），但是在vGluT2+的丘脑区域几乎没有观察到ɑSyn病变（图3A4-A5）。这一结果与上述内源性ɑSyn在皮层和丘脑区域不同的表达水平相一致。
图3 αSyn聚集破坏vGluT1+的皮质- BLA传输。
（图源：Chen L, et al., eLife, 2022）
接下来，研究者们将重点放在了ɑSyn病变是如何影响皮层和丘脑对BLA的谷氨酸能突触传递传递上。利用电生理技术，研究者们将刺激电极分别放在BLA的外囊（external capsule）和内囊（internal capsule）上可以分别激活BLA的皮层和丘脑输入。结果发现，PFF注射后一个月，电刺激诱导产生的皮层-BLA兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic currents，EPSC）幅度明显低于对照组（图3D-E）。然而，丘脑-BLA的EPSC幅度却不受影响（图3F-3G）。为了避免潜在的技术问题，研究者们还利用了光遗传技术进一步确认了上述结果。以上结果表明，ɑSyn的存在使得vGluT1+的皮层神经元及其轴突末端更易受到ɑSyn病变的影响。
前人研究表明在PFFs模型中，ɑSyn病变的发展依赖于内源性ɑSyn的表达。因此研究者们推测敲除内源性ɑSyn的表达可以使得vGluT1+的皮层神经元及其轴突末端免受PFFs诱导的ɑSyn病变的影响。利用了ɑSyn敲除小鼠，研究者们发现PFFs组中的皮层-BLA的兴奋性传递与对照组无差异，从而验证了研究者们的推测。
为了研究ɑSyn病变是如何影响vGluT1+的皮层神经元到BLA的传递的，研究者们对PFFs和对照小鼠的大脑切片进行了vGluT1+免疫组化分析。结果显示，PFFs组中的vGluT1+信号的密度与对照组并无差异（图4A-C），表明PFFs注射一个月后皮层轴突末端尚未产生结构上的退行性病变。因此，研究者们接下来将研究的重点放在了皮层-BLA突触传递的功能性变化上。利用电生理学结合光遗传学的方法，研究者们发现，ɑSyn异常聚集不改变突触前谷氨酸的释放概率，但是降低其量子释放的频率。综合上述结果，研究者们认为皮层-BLA的兴奋性传递减弱是由于囊泡释放位点的减少造成的。
图4 αSyn病理导致功能性皮质-BLA输入数量的减少
（图源：Chen L, et al., eLife, 2022）
研究者们还检测到了AMPA受体和NMDA受体介导的EPSC幅度的比值（AMPA/NMDA ratio）在PFFs组中明显降低（图4K-L）。此外，研究者们还观察到在PFFs组中AMPA受体介导的EPSC的内向整合有所增强（图4M），提示在PFFs的小鼠脑内GluA2缺失的、钙通透的AMPA受体对皮层-BLA的兴奋性传递的贡献有所增加。而在丘脑-BLA的传递中，研究者们没有观察到PFFs和PBS组在AMPA/NMDA ratio和AMPA受体内向整合上存在差异。以上结果表明ɑSyn病变可特异性地抑制皮层-BLA的AMPA受体介导的兴奋性传递。
研究表明，ɑSyn在细胞质中的异常聚集会导致突出前可溶性的ɑSyn的表达降低，导致ɑSyn对突触囊泡池的调节作用受到影响。为了进一步证实这一结论，研究者们利用免疫荧光的方法对vGluT1+轴突末端中的ɑSyn表达情况进行了研究。研究者们利用两种不同的ɑSyn单克隆抗体发现，在PFFs注射小鼠的BLA中，vGluT1+轴突末端中的可溶性的ɑSyn单体表达明显降低。研究者们想进一步知道ɑSyn的表达减少是否会影响皮层-BLA突触传递的短期突触可塑性。利用电生理技术，研究者们对皮层-BLA纤维末梢进行了反复长时程刺激，进而揭示突触前囊泡的动态变化。在正常对照小鼠上，研究者发现皮层-BLA的EPSC逐渐减小（图6A1-A2），提示突触前囊泡的逐渐减少。然而在PFFs注射小鼠中，皮层-BLA的EPSC减小的更快且幅度更大（图6A1-A2）。采用ɑSyn敲除小鼠，研究者们观察到类似的突触前囊泡的快速清空过程。以上结果表明ɑSyn在维持和调动突触囊泡的方面起到了至关重要的作用，且ɑSyn功能丧失对突触可塑性的影响显著。另外，ɑSyn的病理性聚集导致轴突末端可溶性ɑSyn的含量减少，从而导致囊泡耗竭加快并损害了短期突触可塑性。
图5轴突末梢可溶性αSyn随病理发展而减少
（图源：Chen L, et al., eLife, 2022）
前人研究证实ɑSyn的表达表现出脑区和细胞类型特异性，例如其只表达在谷氨酸能和多巴胺能神经元中，而在抑制性的GABA能神经元中却无表达[10]。而该研究进一步揭示了ɑSyn在基底杏仁核（BLA）纹状体中特异性地表达在vGluT1+轴突末端，提示ɑSyn在谷氨酸能神经元中的表达也存在细胞核突触特异性。此外，研究者们还发现在PFFs注射后一个月，富含ɑSyn的vGluT1+的皮层-BLA传递被显著抑制，而无ɑSyn表达的vGluT2+的丘脑-BLA传递则不受影响。而在机制方面，研究者认为皮层-BLA传递被显著抑制是由于突触前可释放位点的减少以及突触后AMPA受体介导的突触反应受损造成的。另一方面，缺乏GluA2的AMPA受体的相对贡献增加被研究者们认为是对皮层-BLA兴奋性突触传递减少的一种代偿机制。
该研究进一步证实了ɑSyn表达水平较高的神经元或轴突末梢相对于缺乏ɑSyn或表达较少的神经元或轴突末梢更易受到ɑSyn病变的影响[11-13]。值得注意的是，那些vGluT2+和酪氨酸羟化酶阳性的中脑多巴胺神经元及其投射在纹状体的轴突末端对神经退行性病变具有更强的抗性[14, 15]，而ɑSyn在vGluT2+的神经元或轴突末梢中缺失可能是主要原因之一。
αSyn正常功能的丧失一直被认为是αSyn病变中一个重要方面，但该方面的研究明显滞后于其他相关方向。通过电生理学方法，研者们发现轴突末端部分或完全去除αSyn会导致对皮质-BLA突触传递重复刺激的短期抑制增强。短期突触可塑性是神经元的一种重要的“增益控制”机制，使得神经元能够以一种输入特异性的方式平衡自己对不同输入信号的反应[16]。该研究发现BLA神经元的皮层和丘脑输入表现出不同的短期可塑性，这可能这可能反映了它们对情绪相关记忆和行为形成的不同贡献[17]。生理上，突触特异性αSyn的存在可能是这两种输入的短期可塑性分布差异的基础。
该研究从两个方面揭示了αSyn对皮层-BLA突触传递的影响。第一，αSyn异常聚集产生的毒性作用能抑制皮层-BLA的突触传递。第二，αSyn正常生理功能的缺失导致皮层-BLA突触传递的短期抑制增强。由此，导致BLA神经元对来自皮层的持续和重复性感觉输入反应减弱。这些环路变化可能解释了为什么PD患者中皮层与BLA的功能联系减弱，而丘脑与BLA的联系不受影响。同样也解释了为什么PD患者BLA对厌恶感觉输入无反应[8, 18]。
原文链接：https://elifesciences.org/articles/78055
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参考文献（上下滑动阅读）
[1] Burre, J., M. Sharma, T. Tsetsenis, V. Buchman, M.R. Etherton, and T.C. Sudhof, Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro. Science, 2010. 329(5999): p. 1663-1667
[2] Runwal, G. and R.H. Edwards, The Membrane Interactions of Synuclein: Physiology and Pathology. Annu Rev Pathol, 2021. 16: p. 465-485.
[3] Mezey, E., A.M. Dehejia, G. Harta, N. Tresser, S.F. Suchy, R.L. Nussbaum et al, Alpha synuclein is present in Lewy bodies in sporadic Parkinson's disease. Mol Psychiatry, 1998. 3(6): p. 493-499.
[4] Angot, E., J.A. Steiner, C. Hansen, J.Y. Li, and P. Brundin, Are synucleinopathies prion-like disorders? Lancet Neurol, 2010. 9(11): p. 1128-1138
[5] Uemura, N., M.T. Uemura, K.C. Luk, V.M. Lee, and J.Q. Trojanowski, Cell-to-Cell Transmission of Tau and alpha-Synuclein. Trends Mol Med, 2020. 26(10): p. 936-952.
[6] Janak, P.H. and K.M. Tye, From circuits to behaviour in the amygdala. Nature, 2015. 517(7534): p. 284-292.
[7] Bowers, D., K. Miller, A. Mikos, L. Kirsch-Darrow, U. Springer, H. Fernandez et al, Startling facts about emotion in Parkinson's disease: blunted reactivity to aversive stimuli. Brain, 2006. 129(Pt 12): p. 3356-3365.
[8] Hu, X., X. Song, Y. Yuan, E. Li, J. Liu, W. Liu et al, Abnormal functional connectivity of the amygdala is associated with depression in Parkinson's disease. Mov Disord, 2015. 30(2): p. 238-244.
[9] Harding, A.J., E. Stimson, J.M. Henderson, and G.M. Halliday, Clinical correlates of selective pathology in the amygdala of patients with Parkinson's disease. Brain, 2002. 125(Pt 11): p. 2431-2445.
[10] Taguchi, K., Y. Watanabe, A. Tsujimura, and M. Tanaka, Brain region-dependent differential expression of alpha-synuclein.J Comp Neurol, 2016. 524(6): p. 1236-1258.
[11] Surmeier, D.J., J.A. Obeso, and G.M. Halliday, Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nat Rev Neurosci, 2017. 18(2): p. 101-113
[12] Thakur, P., W.H. Chiu, J. Roeper, and J.A. Goldberg, alpha-Synuclein 2.0 - Moving towards Cell Type Specific Pathophysiology. Neuroscience, 2019. 412: p. 248-256.
[13] Vasili, E., A. Dominguez-Meijide, M. Flores-Leon, M. Al-Azzani, A. Kanellidi, R. Melki et al, Endogenous Levels of Alpha-Synuclein Modulate Seeding and Aggregation in Cultured Cells. Mol Neurobiol, 2022. 59(2): p. 1273-1284.
[14] Buck, S.A., B.R. De Miranda, R.W. Logan, K.N. Fish, J.T. Greenamyre, and Z. Freyberg,VGLUT2 Is a Determinant of Dopamine Neuron Resilience in a Rotenone Model of Dopamine Neurodegeneration. J Neurosci, 2021. 41(22): p. 4937-4947.
[15] Steinkellner, T., W.S. Conrad, I. Kovacs, R.A. Rissman, E.B. Lee, J.Q. Trojanowski et al, Dopamine neurons exhibit emergent glutamatergic identity in Parkinson's disease. Brain, 2022. 145(3): p. 879-886.
[16] Abbott, L.F., J.A. Varela, K. Sen, and S.B. Nelson, Synaptic depression and cortical gain control. Science, 1997. 275(5297): p. 220-224.
[17] Sigurosson, T., C.K. Cain, V. Doyere, and J.E. LeDoux, Asymmetries in long-term and short-term plasticity at thalamic and cortical inputs to the amygdala in vivo. Eur J Neurosci, 2010. 31(2): p. 250-262
[18] Yoshimura,
N., M. Kawamura, Y. Masaoka, and I. Homma, The
amygdala of patients with Parkinson's disease is silent in response to fearful
facial expressions. Neuroscience, 2005. 131(2): p. 523-534
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