Mol Neurobiol︱朱立新/郭家松团队揭示基底膜蛋白Perlecan在脊髓损伤后血脊髓屏障功能恢复中的重要作用

撰文︱谢昌楠，王一涵

责编︱王思珍，方以一

编辑︱夏   叶

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的临床中枢神经系统创伤性疾病，导致患者运动和感觉功能丧失，甚至瘫痪乃至死亡，对患者身心和社会健康产生毁灭性的后果。脊髓损伤在病理生理学上分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤破坏血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB），引起各种炎性细胞因子、中性粒细胞和巨噬细胞等浸润病灶区域，导致继发性损伤[1]。随后，继发性损伤引发一系列级联反应，包括神经元和胶质细胞死亡、炎症反应和胶质纤维瘢痕，导致轴突再生失败[2]。因此，保持BSCB的完整性是减少继发性损伤以及促进脊髓损伤修复的关键。

Perlecan是基底膜重要组成成分，具有维持血管完整性和神经保护作用。脊髓损伤后引起基底膜蛋白降解和合成，导致紧密连接（tight junctions，TJs）等血管壁结构异常，增加BSCB的通透性和继发性炎症反应[3, 4]。相比于胶原蛋白Collagen IV和层粘连蛋白Laminin，Perlecan对脑卒中反应最敏感的基底膜成分，表明Perlecan在中枢神经系统疾病中具有重要作用[5]。此外，临床证据显示，在人脑动静脉畸形和脑淀粉样血管病患者中Perlecan表达变化与疾病进展具有相关性[6, 7]。但是对于脊髓损伤后Perlecan的变化及功能尚无报道。

2022年10月10日，南方医科大学珠江医院朱立新教授和基础医学院郭家松教授课题组合作在Molecular Neurobiology上发表了题为“Perlecan improves blood spinal cord barrier repair through the integrin β1/ROCK/MLC pathway after spinal cord injury”的研究。该研究观察到Perlecan特异性定位于血脊髓屏障基底膜。在脊髓损伤后，Perlecan发生降解/重塑过程。过表达Perlecan可以降低脊髓损伤后BSCB通透性、减少炎症反应、改善小鼠运动功能和神经再生。此外作者证实了Perlecan通过与integrin β1相互作用，抑制下游ROCK/MLC信号通路，减少TJs相关蛋白的分解，改善脊髓损伤后BSCB的完整性，为脊髓损伤的治疗提供了新思路。

这项研究首先检测了Perlecan蛋白在小鼠脊髓的血脊髓屏障结构各个组分中表达定位情况（图1A-F）。结果显示，Perlecan在小鼠脊髓中特异性定位于基底膜（Laminin和Collagen IV），同时被内皮细胞（CD31）、血管成纤维细胞/周细胞（ACTA2）和星形胶质细胞足突（GFAP）包围，但是不表达于小胶质细胞。此外，脊髓损伤后可以观察到Perlecan发生降解和重塑过程（图1G-J）。提示Perlecan蛋白与脊髓损伤后血脊髓屏障功能相关。

图1 Perlecan定位于基底膜，脊髓损伤后发生降解/重塑过程

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

为了进一步明确Perlecan在脊髓损伤中的作用，作者利用CRISPR/Cas9的SAM系统过表达Perlecan，并且进行脊髓损伤造模。通过游泳实验、足迹实验、免疫荧光染色、电镜实验检测小鼠运动、神经元存活和轴突再生的情况。结果显示过表达Perlecan改善脊髓损伤后运动功能恢复和轴突再生(图2)。提示Perlecan蛋白促进脊髓损伤后运动及神经功能恢复。

图2 过表达Perlecan促进脊髓损伤运动及神经功能恢复

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

既往研究表明，脊髓损伤导致炎症细胞及因子增加和免疫细胞的募集与血脊髓屏障基底膜破坏密切相关[8]。因此，作者检测了过表达Perlecan在脊髓损伤后炎症反应情况。为验证这一点，课题组通过免疫荧光和qPCR实验发现过表达Perlecan减少脊髓损伤后巨噬细胞/小胶质细胞和白细胞浸润，促进抑炎因子表达（图3）。

图3 过表达Perlecan减少脊髓损伤后炎症反应

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

为了研究Perlecan是否通过影响BSCB的通透性来减少炎症反应，作者进行了伊文思蓝染色和免疫荧光，发现在过表达Perlecan减少脊髓损伤后伊文思蓝和纤维连接蛋白（Fibronectin）渗漏（图4A-C）。此外，western blotting和电镜发现脊髓损伤后破坏TJs，而过表达Perlecan减少TJs降解和改善TJs结构（图4D-E）。这些结果表明Perlecan通过减少脊髓损伤后TJs的拆卸改善BSCB通透性。

图4 过表达Perlecan减少脊髓损伤后TJs拆卸改善BSCB通透性

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

既往研究表明，ROCK/MLC信号通路介导的应激纤维形成可以通过收缩肌动蛋白，对细胞-细胞/细胞-细胞外基质相互作用的约束力产生向心性张力，导致TJs开放和BBB通透性增加[9,10]。为了研究Perlecan改善TJs结构及BSCB通透性是否是通过ROCK/MLC信号通路，作者通过western blotting和免疫荧光实验，观察到过表达Perlecan减少ROCK1和P-MLC表达（图5）。此外，内皮细胞integrin β1与细胞外基质相互作用可以稳定TJs和BBB/BSCB完整性[11,12]。作者通过qPCR、western blotting和在体注射integrin β1抑制剂GRGDSP抑制integrin β1功能，发现过表达Perlecan促进integrin β1表达，另外GRGDSP给药组脊髓损伤小鼠逆转ZO-1、P-MLC表达和BSCB通透性（图5）。这些结果表明Perlecan通过与interginβ1相互作用抑制ROCK/MLC信号通路，减少脊髓损伤后TJs的拆卸改善BSCB通透性。

图5 过表达Perlecan通过interginβ1/ROCK/MLC信号通路减少脊髓损伤后TJs拆卸改善BSCB通透性

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

图6 Perlecan在脊髓损伤后BSCB修复的模式图

（图源：Changnan Xie, et al., Mol Neurobiol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究表明Perlecan特异性定位于血脊髓屏障（BSCB）基底膜，脊髓损伤后发生降解和重塑过程。过表达Perlecan通过与interginβ1相互作用，抑制下游ROCK/MLC信号通路，从而抑制炎症反应，促进血脊髓屏障修复和神经功能恢复。这项研究的不足之处在于脊髓损伤后Perlecan如何发生降解和重塑过程尚不完全清楚。此前的研究表明，Perlecan在缺血性脑卒中后数小时内可以被蛋白酶（MMPs、组织蛋白酶等）切割形成各种降解产物[13]。然而具体何种蛋白酶和Perlecan降解产物参与脊髓损伤后功能恢复尚不清楚，值得进一步研究。此外，先前研究表明，Perlecan主要由内皮细胞和星形胶质细胞分泌和维持BSCB的功能[3]。并且胶质瘢痕形成和血管生成是脊髓损伤后两周内的主要生物学事件，表现为广泛的星形胶质细胞激活和新生血管形成[14]。因此作者猜测Perlecan重塑可能是由激活的星形胶质细胞和新生内皮细胞大量分泌Perlecan所致。另一方面，Perlecan如何调控ROCK/MLC信号通路的机制尚不清楚。文献报道，在创伤性脑损伤中，TIMP1与intergin β1相互作用抑制FAK/RhoA通路，促进F-actin解聚和内皮细胞结构稳定，导致BBB功能恢复[15]。本研究结果表明，Perlecan通过与intergin β1相互作用，抑制下游ROCK/MLC信号通路，从而抑制应激纤维形成，改善脊髓损伤后BSCB的通透性和TJs完整性。然而Perlecan与intergin β1相互作用介导ROCK/MLC通路以促进BSCB恢复需要进一步探索。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s12035-022-03041-9

基金支持：国家自然科学基金面上项目编号：82071386，81974329，81672140；广东省自然科学基金项目编号：2017A030312009，2017A030313111；再生医学与健康广东实验室重点研发计划项目编号：2018GZR110104008；广东省精神疾病重点实验室科研资助项目编号：N201904

朱立新（左），郭家松（右）

（照片提供自：朱立新和郭家松实验室）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

朱立新，博士，教授、博士生导师、科主任、骨科中心主任。南方医科大学珠江医院骨科中心主任兼脊柱外科主任，广东省医师协会脊柱外科分会主任委员,广东省生物医药工程协会常务理事，广东省生物医药工程协会脊柱外科工程专业委员会主任委员，广东省医学会脊柱外科专业委员会副主任委员，广东省医学会脊柱外科专业委员会非融合学组组长、SICOT中国部数字骨科学会常委。从事骨组织工程以及脊髓损伤与修复研究，以通讯作者或第一作者在Biomaterials、ACS Appl Mater Interfaces、Molecular Neurobiology、Applied Materials Today等国际主流期刊发表SCI论文20余篇。主持国家自然基金2项，省部级基金10余项，获国家专利2项，参编专著5部，获广东省科技进步二等奖1项，全军医疗成果二等奖3项，全军医疗成果三等奖4项。

郭家松，博士，留美博士后、教授、博士生导师、国家重点学科副主任南方医科大学基础医学院组胚教研室副主任，珠江医院脊柱外科双聘教授，广东省组织构建与检测重点实验室副主任、广东省高校千百十人才计划省级对象，解放军总后优秀教师。现为中国解剖学会再生医学分会副主委、中国研究型医院学会神经再生与修复专业委员会常委、广东省解剖学会常务理事、广东省脑发育与脑病防治学会细胞分会副主委、《Neural Regeneration Research》及《中国临床解剖学杂志》等杂志编委。主要从事周围及中枢神经损伤与修复研究，在Annals of Neurology、Advanced Healthcare Materials、Molecular Neurobiology、J Neuroinflammation等国际主流期刊发表SCI论文50余篇，获授权专利8项。主持国家自然科学基金6项，以及中国脑计划胶质细胞项目子课题、国家重点基础研究计划（973计划）子课题、广东省高层次人才项目等课题。主编教材6本、副主编及参编18本教材。培养的研究生十人次获得过省级以上奖励（如博士国家奖学金、省级优秀硕士及国内会议论文特等奖等）。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完