Nat Neurosci 综述︱突触前光遗传学工具概览

来源︱枢密科技

撰文︱枢小密

责编︱王思珍，方以一 

编辑︱夏   叶

光遗传学技术可在特定细胞群体中表达光敏感蛋白，并通过光照在亚细胞、细胞、环路和行为有机体等层次上操控细胞活动。因其对靶向目标的专一性，操纵时间上的快速性和精确性，在神经科学领域的应用越来越广泛。

尽管光遗传学在神经科学中的应用传统上侧重于控制胞体树突水平的尖峰活性，但直接操纵突触前功能的光遗传学的范围正在扩大。突触前定位的视蛋白与末端的光刺激相结合，允许光介导的神经递质释放、突触前抑制、突触可塑性的诱导等。光遗传学在神经元突触前调控方面具有独特的优势。首先，通过特定的光遗传学工具可对突触前功能进行时间精确性的操控。其次，使用光遗传学激活轴突末端可揭示两个神经元群之间的突触连接，使用光遗传学抑制突触可揭秘突触在信号传导、网络振荡、行为功能中的作用。最后，突触前光遗传学能够对神经递质的释放效率进行分级调控，这种对递质释放的动态调控可帮助研究突触活性在信息处理中的作用。

近期，德国神经退行性疾病研究中心（DZNE）Benjamin R.Rost与以色列魏茨曼科学研究所Ofer Yizhar 团队合作在Nature Neuroscience发表题为“Optogenetics at the presynapse”综述文章，本综述结合轴突末端独特的细胞生物学，总结了光遗传学工具在突触前的应用(种类和应用策略)，并概述研究领域内的未来发展方向。

光遗传学工具的生物物理特征

一、视紫红质

视紫红质分为I型和II型，I型视紫红质来源于原核和真核微生物、藻类、真菌甚至病毒，其进化出的各种功能可用于操纵细胞生理。在大多数微生物视蛋白中，共价结合的辅因子视黄醛在光子吸收后从全反式构型异构化为13-顺式构型。这种光反应是循环的，可根据完成光循环所需的时间重复激活。视紫红质通道蛋白(ChRs)根据传导性分为阳离子传导的ChRs(CCRs)和阴离子传导的ChRs(ACRs)。CCRs和ACRs分别对特定的阳离子和阴离子没有选择性。

II型视紫红质蛋白来源于动物中特殊的G蛋白偶联受体(GPCRs，由光激活，并将视黄醛作为发色团)。虽然II型视紫红质与I型视紫红质没有序列同源性，但它们与微生物视紫红质具有相同的7个跨膜α-螺旋结构和视黄醛结合位点。在视觉型II型视紫红质(如视杆和视锥蛋白)中，11-顺式视黄醛在光子吸收后异构化为全反式，从而通过受体的构象变化触发G蛋白信号传导。但相比于微生物视紫红质，光照会破坏视黄醛和视蛋白之间的共价键结合，所有反式视黄醛都必须重新异构化，如果重新异构化所需的酶缺乏，功能性视觉视紫红质将无法再生。也就是说它们漂白了，无法再传递信号。相比之下，在脊椎动物和无脊椎动物中都存在的非视觉型II型视紫红质可以对结合的发色团进行重新异构化，以实现双稳态状态。因此，这些双稳态、非漂白的II型视紫红质在神经元或其他可兴奋细胞中异位表达时具有主要优势。

图1 视紫红质蛋白的分类、结构和功能

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

二、蓝光受体

大部分用于光遗传学的光感受器是以黄素作为发色团的蛋白质，即黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和核黄素，所有这三种黄素在哺乳动物组织中都是充分可用的。蓝光受体的吸收光谱高达500nm，因此可与对绿光和红光敏感的光遗传学工具互补。虽然蓝色光谱限制了对深层组织的穿透能力，但可通过双光子激发来完成。

与视紫红质不同，蓝光受体(BLRs)是控制各种效应蛋白功能的可溶性蛋白质。重要的是，由于大多数BLRs显示残余暗活性，因此，它们应被视作光依赖性模拟活性调节剂。相比之下，视紫红质在无光时通常不具有活性。另外，因为BLR信号的终止依赖于热弛豫效应，所以无法对这种光感受器进行精确的时间控制。

BLR家族可分为光-氧-电压结构域(LOV)，利用FAD的蓝光传感器(BLUF)结构域和隐花色素(CRYs)。LOV结构域一般来源于高等植物和微藻类的趋光素，以非共价方式结合FMN。BLUF结构域中，黄素发色团非共价结合，但活化机制与LOV结构域不同。BLUF结构域的活化只引起非共价电子键的变化，而不是氧化状态的变化和加合物的形成。尽管还没有完全阐明这些细微的蛋白质改变，但BLUF结构域具有持久的信号状态(数秒至数分钟)。CRYs存在于动植物，虽然与光解酶蛋白高度同源，但其不能与DNA相互作用。迄今为止，CRY的激活机制尚未达成共识。

图2 蓝光受体的分类、结构和功能

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

三、光敏剂

遗传编码的光敏剂都来自拟南芥向光素2的绿色荧光蛋白(GFP)或LOV2结构域。在光照下，它们产生活性氧(ROS)而不是荧光。在20-150 nm光下，单线态氧(O₂)会氧化半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸侧链，从而破坏蛋白质功能。因此，与蛋白质融合的光敏剂能够实现原位时空精确的生色团辅助的光失活(CALI)。然而，与其他光遗传学工具相比，光敏剂很难使用。因为有必要仔细评估与非特异性组织损伤相关的特异性蛋白失活程度。

图3 光敏剂的分类、结构和功能

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

靶向轴突和突触前的光遗传学驱动器

由于大多数光遗传学工具来源于种系发生很远的物种，在哺乳动物细胞中缺乏转运信号。在高表达水平下常常会导致无效的膜定位、细胞内聚集和细胞毒性。突触前蛋白在胞体内合成并在相当长的时间和距离内运输。突触囊泡蛋白、活性区成分和突触前膜蛋白存在不同的转运机制，运用这些转运机制可将光遗传工具靶向轴突末梢。突触素是含谷氨酸和GABA囊泡中都最丰富的蛋白，特别适用于将光遗传驱动器和荧光蛋白靶向突触囊泡。重要的是，突触素的过度表达似乎不会影响啮齿动物神经元的突触传递。而研究表明，将光遗传学工具有效靶向轴突质膜就困难得多。因为轴突膜蛋白必须通过轴突隔室及胞体和树突边界处的轴突起始段，而且膜蛋白轴突转运或突触前定位的通用信号序列目前尚未明确。尽管如此，目前已知有两种机制有助于轴突定位：一是通过胞体树突隔室优先胞吞的单向膜插入；二是特异性囊泡介导的轴突导向转运。

图4 光遗传学驱动器的轴突转运和突触前定位

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

光遗传学工具的突触前应用

一、光诱导神经递质释放

对于视紫红质通道蛋白辅助的环路映射(CRACM)，CCRs表达于一个脑区，然后通过目标(靶向)脑区的局部光照来评估功能连接。机制上，光电流使轴突去极化并引起动作电位(AP)。在轴突末端AP通过电压门控通道引起Ca²⁺内流，从而触发神经递质释放。光诱导的突触后电流表明CCR表达的神经元群和突触后神经元群之间存在功能性突触。CRACM广泛应用于研究基因定义神经元的功能连接，结合细胞特异性的基因敲除或敲低策略，CRACM还可研究蛋白质损失对递质释放的影响。

图5 光诱导神经递质释放的概念和缺陷

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

二、光遗传抑制神经递质释放

光遗传抑制神经递质释放是光遗传兴奋的重要补充途径。因为它规避了体内不受控制的逆行性AP引起的问题。突触前光遗传抑制的实验策略有三种方案：第一种是通过外向的Arch3、ArchT97、Jaws98质子泵以及内向的NpHR氯离子泵引起轴突末梢超极化，以抑制AP传递和减少突触前Ca²⁺内流。这种光驱动离子泵的突触前抑制已经应用于抑制不同脑区之间自发网络振荡的传播，及体内沉默特异性突触连接以研究它们在行为中的作用。

第二种是通过GPCRs抑制递质释放。突触前Gα_i/o偶联受体是突触前递质释放的天然抑制剂。主要通过异三聚体G_i/o蛋白的βγ亚基降低电压门控钙通道(VGCCs)开放概率，从而抑制递质释放。由于囊泡融合对突触前Ca²⁺的非线性依赖性，Ca²⁺内流的适度减少会显著降低神经递质释放。此外，βγ亚基还可通过直接干扰释放机制抑制释放。基于很多II型视紫红质与Gα_i/o或相关转导蛋白(Gα_t)偶联，研究显示，在视紫红质有效定位到轴突末端前提下，神经元中外源性表达的光敏性GPCRs可能传导光门控突触前抑制。目前，用于突触前抑制的最佳GPCRs是七鳃鳗副蛋白酶(LcPPO)和蚊子OPN3。在神经元中，LcPPO和转运增强版eOPN3[将ER转运信号(ER)与高尔基体运输信号(ts)一起添加到OPN3，产生增强的OPN3-ts-mScarlet-ER]，通过VGCCs抑制突触前Ca²⁺内流，进而抑制神经递质释放。

第三种是破坏递质释放机制。破坏释放机制的光遗传工具可用于长期抑制神经递质释放数小时或数天。基于这种方法的第一个工具是InSynC(利用CALI抑制突触)。光激活的光敏剂miniSOG附着于突触囊泡的胞质端，在持续光照下产生ROS，进而氧化突触蛋白。在培养的神经元中，几分钟就足以损害AP诱发的递质释放，而同时增加自发的递质释放。研究表示肉毒杆菌或破伤风杆菌神经毒素对可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体(SNARE)蛋白的水解作用能高效消除突触传递。基于AsLOV2衍生的iLID二聚体系统开发了一种囊泡附着的光控拆分蛋白互补系统-肉毒杆菌神经毒素B(vPA-BoNT)，可特异性裂解VAMP2(SNARE蛋白核心)。vPA-BoNT的光激活降低了分离培养物中自发微兴奋性突触后电流(EPSC)的频率，使急性小鼠脑切片中的诱发递质释放减少50%。InSynC或vPA-BoNT可持续长时间的破坏释放机制以抑制递质释放，但由于起效需要十多分钟，恢复取决于蛋白合成过程，所以操控的时间精确性较差。

图6 光遗传抑制神经递质释放的不同原理

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

图7 光遗传学的突触前抑制的验证

（图源：Rost B R, et al., Nat Neurosci, 2022）

三、光诱导的突触前增强效应

突触强度的持久变化可改变神经元记忆痕迹。研究表明突触后长时程增强(LTP)的结构和功能机制与记忆引导的行为表现关系密切，但在整个中枢神经系统的各种突触中发现的突触前LTP在学习和行为输出中的作用尚不清楚。

以往研究使用高频电刺激通过蛋白激酶A和鸟嘌呤核苷酸交换因子Epac2增加cAMP水平进而增加囊泡释放率和激活新的释放位点，导致递质释放持续增加，诱导突触前LTP。但高频刺激轴突可能导致非预期的脱靶效应，造成很难评估突触前LTP对活体动物的影响。因此最近研究通过光遗传诱导直接升高轴突末端的cAMP水平来产生突触前LTP，即将光激活的腺苷酸环化酶bPAC连接到突触素的胞质C末端，形成的蓝光激活“synaptoPAC”使突触传递迅速增加，只增强具有突触前可塑性的末端递质释放。SynaptoPAC可能是一种有用的工具，用于模拟活体动物遗传定义突触的突触前可塑性，并可能有助于阐明突触前增强的行为作用。

总结与展望

多年来轴突独特的生理和复杂的运输机制阻碍了光遗传学在突触前末梢的应用。但基于对轴突独特的细胞内环境和光遗传驱动器的生物物理特性之间的相互作用的更好理解，开发了专门适用于突触前应用的光遗传工具。更好的亚细胞靶向性以实现轴突的独家定位、更复杂的基因表达系统以实现工具表达的活性依赖和连接依赖控制等方面技术进步的结合，可改善光遗传的空间和时间精确性。但将两组神经元之间的特定突触作为光遗传学操纵的唯一靶点仍有局限性。

使用光遗传学工具对神经突触传递进行双向调控是一个很有前景的研究方向，如突触前抑制optoGPCRs(非视觉型II型视紫红质，与GPCRs偶联)和兴奋性CCRs的结合可以实现对递质释放的双向调控。这些工具一方面可通过目标区域的CCRs激活轴突，同时又可通过optoGPCR抑制局部递质释放。总的来说，突触前的光遗传学工具以无与伦比的时空分辨率为神经科学家提供了多种实验方法来进行精细地操作神经元，了解它们的分类和应用对于之后如何使用以及光遗传学的发展至关重要。这些工具将助力神经科学进一步的发展和临床转化。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41593-022-01113-6

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本文完