多巴胺（Dopamine，DA）, 是中脑多巴胺神经元（Dopamine Neuron，DaN）分泌的一种神经递质，具有控制和调节多种生命功能，例如肢体运动、快乐情绪、奖惩系统和激励系统[1]。而多巴胺神经元细胞膜上多巴胺转运体（Dopamine transporter，DAT）可以将分泌到神经元外的dopamine重新转运回神经元内，这样机体就多了一层调节脑组织中dopamine含量进而调控下游生命功能的精巧机制。因而与调节DAT转运功能和其在多巴胺神经元细胞膜上分布的相关研究就显得尤为重要。我们熟知的毒品可卡因（Cocaine）就是通过阻断DAT的转运功能而提高细胞外的dopamine水平来让相关神经通路持续高度兴奋而产生快乐的感觉。除了抑制DAT的转运功能外，研究人员近些年来也发现Cocaine也可以调节DAT在多巴胺神经元细胞膜上的分布[2, 3]。但由于缺乏有力的工具和技术，关于Cocaine如何调节DAT在Dopamine Neuron细胞膜上的分布所知甚少。为了解决上述难题，近日罗格斯大学（Rutgers University）潘平越博士课题组在iScience上发表题为“Cocaine-regulated trafficking of dopamine transporters in cultured neurons revealed by a pH sensitive reporter”的研究论文，报道了一种基因型荧光探针hDAT-pHluorin，应用这一探针，他们做了一系列关于DAT内吞（internalization）和其在神经元细胞膜上动态分布的研究。为了构建基因型探针hDAT-pHluorin，在DAT的cDNA中选择合适的位点插入pH敏感的荧光蛋白pHluorin的cDNA尤为重要，一方面要保证pHluorin插入不影响DAT蛋白的结构和正常功能，同时要保证发挥pHluorin 的pH敏感荧光探针特点。经过充分的调研分析，作者认为在具有12次跨膜结构的hDAT（人源多巴胺转运体）的第六个胞外区的环（loop）中插入pHluorin是最可能成功的途径。基于此，他们尝试在多个位点插入两端都连有柔性序列（linker）的pHluorin，通过瞬时转染和荧光成像验证，他们排除掉那些表达异常的候选探针并最终选择一个做进一步的验证分析（图1）。图1 hDAT-pHluorin构建示意图和神经元中表达验证及转运DA功能验证（图源：Jacqueline Saenz, et al., iScience, 2022）
首先，通过在原代中脑神经元（primary midbrain culture）中表达候选hDTA-pHluorin并用免疫荧光实验证明它的表达特征和内源性DAT类似，且在神经元细胞体和轴突末端都有正常表达（图1）。第二，为了验证确有一部分hDAT-pHluorin分布在神经元细胞膜上且具能正常转运DA，作者在N2a细胞中转染hDAT-pHluorin并用放射性物质H3标记的DA验证其转运能力，结果证明control组（未转染hDAT-pHluorin）没有转运DA的能力，而转染了hDAT-pHluorin的N2a细胞具备极高的DA转运能力（图1）。而且Cocaine可以大幅（高达90%）抑制hDAT-pHluorin介导的DA转运，这些实验证实hDTA-pHluorin具备正常转运DA的能力。第三，作者验证了hDAT-pHluorin作为荧光探针的可靠性。pHluorin，作为pH敏感性的荧光蛋白，它的基本特征之一就是在低pH（如pH 5.5）条件下，它的激活效率比较低即比较暗，在中性或碱性（pH 7-9）条件下，它的激活效率较高即比较亮。作者通过微灌流系统对表达了hDAT-pHluorin的N2a细胞或者原代中脑神经元的胞体及轴突灌输pH 5.5 的MES溶液，hDAT-pHluorin的荧光强度立即变弱，而换为灌输pH 7.4的NH4Cl，hDAT-pHluorin的荧光强度就立即转亮。这说明pHluorin的pH敏感性特征在hDAT-pHluorin中得到了很好的保存。作者还进一步验证了hDAT-pHluorin用于研究DAT的内吞的可行性。有研究指出激活PKC可以促进DAT内吞，相反地，胰岛素（Insulin）可以抑制DAT内吞而增加其在细胞膜上的分布。通过对表达了hDAT-pHluorin的N2a灌输含有PKC激活剂PMA或Insulin的溶剂，作者观察到hDAT-pHluorin荧光强度有非常明显的下降或升高。这说明hDAT-pHluorin可以有效地示踪DAT的内吞和膜转运活动（图2）。有意思的是灌输Cocaine可以立即降低hDAT-pHluorin的荧光强度，说明Cocaine可以促进DAT的内吞，更令人惊讶的是当停止灌输Cocaine后，hDAT-pHluorin的荧光强度在短短几分钟内立即恢复并且高过实验开始时的荧光强度，这一全新发现暗示着Cocaine调节DAT内吞和膜转运的动态复杂性，并且这也是科研界首次记录到Cocaine调节DAT内吞和膜转运短时程实时活动（图2）。总之，通过一系列验证，潘博士实验室证实了他们发明的荧光探针hDAT-pHluorin是可靠的研究DAT的DA转运功能和其内吞及膜转运的强大工具（图1&2）。图2 hDAT-pHluorin的pH敏感性及在研究DAT内吞及膜转运中的应用（图源：Jacqueline Saenz, et al., iScience, 2022）接下来，潘博士实验室采用hDAT-pHluorin做了一系列应用研究。首先，他们灌输pH 5.5的MES溶液或pH 7.4的NH4Cl溶液通过采集hDAT-pHluorin荧光强度在灌输前后的变化来计算模拟DAT在细胞膜上（hDAT-pHluorin处于中性环境，灌输pH 5.5的MES会降低这部分hDAT-pHluorin的荧光强度）分布量和细胞内（hDAT-pHluorin处于酸性环境，灌输pH 7.4的MES会升高这部分hDAT-pHluorin的荧光强度）分布量。计算发现在原代中脑神经元胞体区、树突区和轴突区分别有23%、36%和73%的DAT分布在细胞膜上，暗示着大量DAT分布在轴突膜上，为其发挥转运DA的功能提供物质基础，这也是人们首次精确计算出DAT在神经元不同部位分布特征。图3 hDAT-pHluorin用于计算DAT在神经元胞体、树突和轴突细胞膜上的分布量（图源：Jacqueline Saenz, et al., iScience, 2022）其次，潘博士实验室研究了长时程（1天或4天）孵育Cocaine对DAT在中脑神经元不同部位的膜分布特征的影响，他们发现孵育Cocaine 4天可以明显增加DAT在神经元轴突膜上的分布，而对细胞体及树突膜上DAT的分布量没有显著影响，首次揭示了Cocaine对神经元上DAT分布的影响具备高度特异性。图4 hDAT-pHluorin用于研究Cocaine对DAT在神经元胞体、树突和轴突细胞膜上分布量的影响（图源：Jacqueline Saenz, et al., iScience, 2022）综上所述，潘博士课题组构建了一种可靠的有效的基因型探针hDAT-pHluorin用于研究DAT在神经元不同部位的内吞、膜转运及膜分布的动态时空分布活动，以及探究Cocaine对这一活动的影响，但其背后深层次的分子机制有待进一步挖掘，而hDAT-pHluorin的问世为相关研究提供了技术基础。并且我相信很快hDAT-pHluorin将单独或与其它探针（如DA探针Rdlight1）一起应用于体内研究，为揭示Cocaine等毒品毒性机理、成瘾机制和帕金森疾病（Parkinson’s Disease，一种因为多巴胺神经元死亡而导致脑内dopmine减少从而引发包括肢体运动障碍在内的多种病症的脑疾病）等生物医学问题提供强有力的技术支持。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105782
1. Klein, M.O., et al., Dopamine: Functions, Signaling, and Association with Neurological Diseases. Cell Mol Neurobiol, 2019. 39(1): p. 31-59.2. Kahlig, K.M. and A. Galli, Regulation of dopamine transporter function and plasma membrane expression by dopamine, amphetamine, and cocaine. Eur J Pharmacol, 2003. 479(1-3): p. 153-8.3. Izenwasser, S., The role of the dopamine transporter in cocaine abuse. Neurotox Res, 2004. 6(5): p. 379-83.