RNA修饰分析方法研究进展(2)——内切酶及质谱法 | m6A专题

2. RNA修饰的定位分析前述的RNA修饰全分析只能提供RNA修饰的整体含量信息, 不能提供相关的序列位点信息。RNA修饰的定位分析对于了解其生物学功能至关重要。测序技术的进步, 特别是高通量测序技术的出现, 加速了RNA修饰的全转录组分布的研究。目前已经建立了多种用于系统分析RNA修饰位置的方法, 包括核酸内切酶酶解法、基于质谱分析的方法以及基于测序的方法等。2.1 核酸内切酶酶解法限制性核酸内切酶方法的原理是基于一些特殊的酶能特异性识别特定的RNA修饰。因此, 通过某些核酸内切酶酶解的模式结合凝胶电泳、逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 、TLC和MS等检测方法能实现RNA修饰的定位分析。Morse等[77]利用乙二醛处理结合RNase T1酶解, 开发了一种通过特异性酶解结合PCR扩增定位RNA中I修饰的方法。首先用乙二醛处理RNA, 乙二醛能同时与G和I反应, 但只有G能与乙二醛形成稳定的加合物, 且能进一步与硼酸盐形成更稳定的复合物。随后使用RNase T1酶解乙二醛化的RNA, G-乙二醛-硼酸盐复合物对RNase T1酶解具有抗性, 因此RNase T1能特异性切割I位点。最后通过RT-PCR进一步分析由RNase T1酶解产生的含I的片段。使用此方法, 在小鼠大脑mRNA中鉴定了两个已知的A至I的编辑位点, 提供了这些位点I存在的直接证据。该方法可以促进RNA中I的定位分析, 也为鉴定新的脱氨酶底物提供了一种新方法。Yu等[78]提出了一种基于RNase H酶解准确灵敏定位RNA中2’ ;-O-甲基化修饰的方法。使用此方法鉴定出两个2’ ;-O-甲基化修饰位点, 分别为非洲爪蟾18S rRNA中的G1448和非洲爪蟾28S rRNA中的A394位点。此外, 还能利用RNase H的位点特异性切割结合[γ-32P]ATP标记的TLC方法对Ψ修饰进行定位分析[79]。此方法不仅能确定RNA中是否含有Ψ修饰, 还能确定Ψ修饰的位点。利用核酸内切酶酶解对RNA修饰进行定位分析需先将待研究的某一种RNA进行分离, 因此该类方法不适用于对丰度很低的mRNA或者长非编码RNA (Long non-coding RNA, lncRNA) 上修饰的研究。芝加哥大学的潘滔课题组开发了一种在单核苷酸分辨率下确定mRNA和lncRNA中m6A修饰位置的新方法[80]。该方法将传统的RNase H位点特异性酶切与连接酶连接法相结合 (SCARLET) , 利用SCAR-LET方法无需提前进行RNA纯化便可实现对待研究RNA的分离。该方法能精确确定mRNA/lncRNA中m6A修饰状态, 且操作简单、无需复杂仪器, 为研究人员提供了一个快速、有效检测RNA修饰的平台。2.2 质谱分析法近年来, 随着质谱技术的快速发展以及数据分析软件的开发, 质谱技术在生物大分子研究方面得到了很好的应用。近10年来, 质谱在RNA研究方面取得了显著的进展, 研究人员开发了一系列用于RNA修饰定位分析和RNA序列分析的方法[81]。2.2.1 基质辅助激光解吸电离质谱分析法2000年, Kirpekar等[82]建立了基质辅助激光解吸电离质谱法 (MALDI-MS) 用于5S rRNA序列分析以及其中修饰的定位分析。使用特异性酶酶解RNA产生寡核糖核苷酸片段后, 通过MALDI-MS直接分析寡核糖核苷酸片段。通过比较实验获得的质谱数据与从基因序列预测的数据来鉴定带有修饰的寡核糖核苷酸片段。为了更快速、灵敏、精确地绘制RNA修饰谱图, 采用两种RNase同时酶解RNA, 在3种细菌的5S rRNA中成功定位了甲基化胞嘧啶。随后该研究组建立了一系列用于定位RNA修饰的MALDI-MS/MS方法[83,84]。该方法灵敏度高、对杂质的耐受性好, 适用于引物延伸或色谱分析技术不适用的情况。                 2.2.2 液相色谱=质谱分析法基于LC-MS的方法用于RNA修饰定位分析, 通常需RNase酶解以获得RNA短片段[29]。对相应的寡核糖核苷酸片段进行LC-MS/MS分析, 可得到确切的碱基组成和序列信息, 通过与基因序列数据比对能确定RNA片段上修饰的序列位点。Mc Closkey课题组在1993年建立了一种LC-ESI-MS方法用于RNA修饰的定位分析[85], 成功定位了E.coli 23S rRNA中的3-Methylpseudouridine (m3Ψ) [86], 超嗜热古细菌P.occultum 5S rRNA中的ac4C和N4-acetyl-2’ ;-O-methylcytidine (ac4Cm) [87], 以及E.coli tmRNA中的5-Methyluridine (m5U) 和Ψ[88]等。为提高检测灵敏度和改善RNA修饰片段的覆盖度, Cao等[89]通过LC-MS/MS开发了质量排除列表方法用于RNA修饰谱图的建立。通过质量排除列表去除未修饰的序列, 只分析含有修饰的酶解产物以产生MS/MS谱图。结果显示, 基于DNA的排除列表可检测的RNA修饰酶解产物的数量增加约20%, 从而有效扩大了酶解产物的MS/MS覆盖范围, 简化了LC-MS/MS谱图。Yamauchi等[90]开发了一种基于MS直接测定RNA中Ψ修饰的方法。通过精确测量由碰撞诱导解离质谱产生的特征性双脱水核苷阴离子 ([C9H7N2O4]1-, m/z 207.04) 来确定含Ψ的RNA片段, 使用Pseudo-MS3确定含Ψ的核苷酸序列。采用此方法鉴定了人类剪接体snRNA中所有已知的Ψ位点, 并在U5和U6 snRNA中新发现了两个Ψ位点。2.2.3 Top-down质谱分析法大多数基于MS方法的研究对象仅限于RNA寡核苷酸片段, 难以获得完整的RNA片段分析。采用Top-down质谱分析法可解决此问题。该方法无需使用核酸酶酶解, 避免了繁琐的酶切和寡核糖核苷酸的分离步骤。通过结合高分辨质谱仪与多种核糖核苷酸的碎裂方式, 如电子脱离解离 (EDD) 、碰撞活化解离 (CAD) 、碰撞诱导解离 (CID) 等, 可对完整的RNA分子直接进行质谱分析, 能提供RNA的序列信息, 并能对RNA转录后修饰进行鉴定、相对定量和定位分析[81,91]。2009年, Mc Luckey等[92]通过离子阱CID的碎裂方式实现了tRNA的Top-down质谱分析, 序列覆盖率达60%。此方法减少了光谱重叠和电荷态模糊的产生, 简化了产物离子谱的解谱过程, 更易于产物离子的鉴定。由于U到Ψ的转化未发生相对分子质量变化, 因此通过对RNA或其片段的简单质谱分析无法区分异构体U和Ψ。根据CAD解离RNA时U (N-糖苷键) 和Ψ (C-糖苷键) 的不同碎裂行为, Taucher等[93]将Top-down质谱分析法用于RNA中Ψ修饰的定位分析。然而, 此方法只能用于标准RNA样品中Ψ的分析, 对于实际样品中Ψ的分析尚需进一步改善。2012年, Breuker实验室[94]建立了结合EDD与CAD两种碎裂方式的Top-down质谱分析法鉴定了RNA修饰的类型和位置。该法对22nt和34 nt长度的RNA分析的覆盖率分别为100%和97%, 对转录后高度修饰的tRNA分析的覆盖率亦可达到89%以上。这表明结合多种解离数据可以提供用于分析RNA修饰的更广泛的序列信息, 能更加精确地确定修饰的类型和位置。近期, Glasner等[91]使用类似的方法实现了对RNA中异构体或非异构形式的甲基化修饰 (m6A, 5-mr C, m5U和3-Methyluridine (m3U) ) 的相对定量和直接定位分析。尽管Top-down质谱分析法对于仪器和样品的要求很高, 但其诸多优点使之成为RNA修饰研究中颇有前景的方法之一[91]。2.2.4 稳定同位素标记-质谱分析法代谢组学中的稳定同位素标记法也可用于RNA修饰研究中。Li等[95]提出了一种基于两个RNA样本的差异标记的RNA酶解物比较分析法 (Comparative analysis of RNA digests, CARD) , 实现了对RNA修饰的简单快速定位。在RNase T1酶解RNA过程中, 使用16O标记参考RNA样品 (已知其完整序列及修饰信息) , 18O标记待测RNA样品 (其序列及修饰信息未知) 。通过组合两个酶解物进行LC-MS分析, 当参考物和待测物之间共享相同序列或转录后修饰时, 将显示为以2 Da分开的二重联物;当两者之间的序列或修饰有差异时, 将产生可用于进一步表征的序列。通过直接比较待测RNA与参考RNA的序列和修饰信息可鉴定RNA修饰的序列特异性差异。Li等[96]应用CARD方法对E.coli的tRNA进行了序列分析。然而, 由于RNase酶解后的tRNA样品中存在天然同位素13C和15N引起的谱图卷积, 使得数据分析具有挑战性。为解决此问题, Wetzel等[97]通过使用富含12C不含13C的培养基, 显著降低了在CARD实验过程的同位素效应, 使tRNA酶解产物的检测得到了35%的改善。Taoka等[98]提出了稳定同位素标记结合LC-MS的分析方法, 用于RNA转录后修饰的系统检测。该方法将体外转录的重同位素标记的参考RNA等量掺入样品RNA溶液中, 使用RNase酶解混合物后进行LC-MS分析。通过分析保留时间的移位和MS信号定量检测转录后修饰的寡核苷酸;通过检测仅包含轻链片段的色谱峰鉴定修饰位点。利用这种方法, 在粟酒裂殖酵母的rRNA中鉴定了122个修饰位点, 并获得单核苷酸分辨率的真核生物rRNA转录后修饰谱图。随后Taoka研究小组[99]运用该法研究了酿酒酵母rRNA的完整化学结构, 并在25S rRNA中第2 345位检测到以前未发现的Ψ。这种以稳定同位素标记为基础的LC-MS方法已被证明是一种有价值的工具, 被广泛用于不同RNA种类的修饰研究。2.2.5 化学标记-质谱法由于有些转录后修饰核苷 (例如Ψ) 与正常核苷相比相对分子质量不变, 因此采用正常的MS分析方法无法实现对这种特定修饰的检测。为解决此问题, Patteson等[100]开发了一种化学标记结合MALDI-MS对RNA中Ψ修饰进行定位分析的方法。该方法利用N-环己基-N’ ;- (2-吗啉乙基) 碳二亚胺对甲苯磺酸盐 (CMC) 选择性标记Ψ, 通过比较标记前后的质谱图可在完整的RNA中鉴定Ψ及其个数;进一步对RNase T1酶切产物进行MALDI-MS分析, 能确定Ψ修饰的序列位置。该方法能直接测定RNA中的Ψ修饰, 还可与其他定位方法联用以完全表征存在于RNA中的转录后修饰。此外, Mengel-Jorgensen等[101]使用类似的化学标记质谱法分析了tRNA中的Ψ修饰和其他修饰。该方法首先使用丙烯腈将tRNA氰乙基化, 随后用RNase A或RNase T1酶解tRNA以进行MAL-DI-MS分析。氰乙基化的寡核苷酸会产生1个53.0 Da的质量增加, 通过比较未处理和丙烯腈处理的样品的质谱图可以确定Ψ修饰的位点。使用该方法, 成功地在E.coli的tRNATyr II中鉴定了1个4-Thiouridine (s4U) 位点和1个Ψ位点。参考文献：[77] Morse D P, Bass B L. 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