协和神外| 哪类胶质瘤母细胞瘤能明显获益于PD-1免疫治疗 美国研究者通过基因测序找到答案

协和神经肿瘤周刊

第12期 

神外前沿-协和神经肿瘤周刊讯，近年来随着免疫治疗技术的兴起，免疫治疗不但在很多恶性肿瘤领域开始了基础和临床方面的探索，而且还在一些病种上取得了大幅进展。

作为脑部最常见的恶性肿瘤，胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）采用PD-1抑制剂免疫治疗后，并没有表现出显著的生存优势。

但PD-1在胶质瘤治疗中，也存在疗效显著的个例，这背后是偶然还是存在着尚未发现的影响GBM对抗PD-1免疫治疗的深层机制呢？

针对这一重要的临床问题，2019年2月，医学类1区的杂志Nature Medicine（IF=32.621）发表了来自美国哥伦比亚大学系统生物学系（Department of Systems Biology, Columbia University）的Junfei Zhao和Andrew X. Chen的关于胶质瘤免疫治疗的文章。

该研究通过比较胶质母细胞瘤患者中对抗PD-1治疗有效和无效人群的基因组以及转录组，发现影响PD-1抑制剂作用于GBM中的关键通路和重要基因突变模式，绘制免疫治疗中GBM的进化树，获得筛选GBM免疫治疗有效患者的关键基因和作用通路的信息，对于指导临床GBM的个体化免疫治疗有重要意义。

文章原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41591-019-0349-y

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编译者按

GBM中免疫治疗持续升温，但是一直缺乏显著的证据支持，最近的一项临床试验也指出在复发GBM中PD-1免疫检查点抑制剂只在8%的患者身上有客观缓解率。抗PD-1免疫治疗主要是通过阻断肿瘤细胞和T细胞的PD-1/PD-L1结合，从而避免T细胞耗竭，增加自身T细胞对肿瘤的杀伤能力。目前抗PD-1免疫治疗疗效的影响因素主要与肿瘤突变负荷和T细胞浸润率有关，而GBM相比较于目前获得较大成功的非小细胞肺癌以及黑色素瘤来说，肿瘤突变负荷低，并且具有免疫抑制的微环境，因此想在GBM中实现PD-1抑制剂治疗是十分困难的。但是临床上仍存在难以解释的获益于免疫治疗的患者，其背后的深层原因可能是GBM免疫治疗突破的契机。

研究方法

本研究入组66例患者进行回顾性研究，入选标准是经过标准治疗后复发GBM的成人患者，复发后进行PD-1抑制剂治疗（pembrolizumab或者nivolumab），并依据疗效分成反应组和非反应组人群。反应组人群的诊断标准为满足下面任何一条：1）PD-1抑制剂治疗后进行手术切除的组织样本大部分只表现出炎性反应，很少或没有肿瘤细胞存在（可能表现出假性进展）；2）至少6个月内MRI显示肿瘤体积维持稳定或者持续缩小。

图1. 研究患者入选标准和实验流程

生存分析

随后对入组患者的临床和个人信息的统计包括反应模式、治疗初始年龄、性别、选用的PD-1抑制剂种类进行了单因素生存分析。发现对PD-1抑制剂的反应性和患者从免疫抑制剂治疗开始的总生存期（OS）显著相关：反应性人群的平均生存期为14.3个月，而非反应性人群的平均生存期仅为10.1个月（P=0.0081，log-rank test）。

图2. 抗PD-1免疫治疗GBM反应组以及非反应组生存曲线

测序结果

进一步研究人员分析了17个患者配对的58个全基因组样本和38个转录组样本，合并39个患者的基因测序结果，并得到如下的结果及分析。

1. 反应组和非反应组差异

检测的肿瘤样本中平均有47个非同义体细胞突变，在反应组和非反应组间，非同义单核苷酸变异数，非整倍体数以及人白细胞抗原I（HLA-I）表达没有显著差异。有报道说在黑色素瘤以及非小细胞肺癌患者中HLA-I基因的相似性影响免疫治疗的生存期，但是在本实验GBM样本中没有显著效果。

2. 基因通路改变和突变差异

肿瘤细胞中PTEN基因缺失可以导致肿瘤浸润T细胞减少，抑制细胞自噬，降低T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，并且在GBM中也证实T细胞可以更有效杀伤PTEN基因野生型的肿瘤细胞。

反应组和非反应组患者的基因突变信息表明，在IDH1野生型患者中，PTEN突变显著聚集在非反应组中（P=0.0063），即便相比于人群中的PTEN突变基线（33%，TCGA）也明显升高（P=0.0018）。

使用单样本基因富集分析（single-sample geneset enrichment analysis, ssGSEA）计算肿瘤样本中的PI3K-AKT通路的基因富集情况，在PTEN突变的PD-1抑制剂非反应组肿瘤中PI3K-AKT通路活性显著高于反应组。并且发现另一条显著改变的MAPK通路，MAPK通路突变在之前的黑色素瘤研究中证明与免疫治疗的效果相关。相比较于人群中的统计突变率（7.8%，TCGA）和非反应组，MAPK通路的基因（BRAF和PTPN11）突变在反应组中更显著（P=0.018）。

图3. 抗PD-1免疫治疗GBM反应组与非反应组调控基因统计

蓝色，反应组样本；黄色，非反应组样本

由于免疫治疗过程中可能存在筛选出低免疫原性肿瘤细胞的作用，因此针对5个患者样本（2个PD-1抑制剂非反应组患者，3个反应组患者）建立免疫治疗前后的进化树。非反应组和反应组表现出不同的进化模式，非反应组表现出线性进化模式，而反应组表现出分支进化模式。在三个反应组患者样本中均有：治疗前的具有表达特定免疫原性新抗原表位的基因，而在治疗后消失的情况。

图4. 反应组与非反应组在治疗中的进化模式

通过T细胞抗原受体（T cell antigen receptor, TCR）和免疫球蛋白RNA序列跟踪肿瘤中淋巴细胞的进化过程，发现非反应组患者具有更高的T细胞克隆多样性（P=0.024），免疫球蛋白的跟踪监测中也发现了同样的规律（P=0.048），说明了B细胞和T细胞在PD-1抑制剂治疗反应性上的协同作用。

图5. 反应组和非反应组的免疫治疗前后TCR多样性

通过分化富集分析MSigDB中的基因信息，发现PD-1抑制剂治疗前，在非反应组样本中有调节性T细胞（Treg细胞）相关的基因富集（P=0.037），其基因表达也更活跃。表达FOXP3的Treg细胞可以抑制自体免疫反应，抑制癌症过继免疫治疗的效果。在免疫治疗的过程中，反应组的肿瘤免疫抑制基因如FOXP3和STAT3，以及调控肿瘤免疫侵袭特征的基因表达更加活跃。

对肿瘤样本的组化结果显示Treg细胞并非来自于肿瘤细胞，对GBM的9000个细胞进行转录组学研究，发现PTEN突变的肿瘤富有免疫抑制的特征。进一步拓扑学分析发现了三个重要的细胞群：小胶质细胞，繁殖旺盛的肿瘤细胞（Ki-67+），具有转移标志物（CD44+）的肿瘤细胞，其中CD44+相关的肿瘤中免疫抑制的特征最显著。

图6. 表达CD44肿瘤细胞免疫抑制环境的细胞组分

上述研究证明PTEN能够在肿瘤免疫微环境的形成中起重要作用，从TCGA数据库提取分析了172个样本中的RNA-seq信息，PTEN突变和FOXP3相关的转录特征以及低肿瘤均一性显著相关（P=0.028）。单样本基因富集分析测量每个样本中的24种免疫细胞的浸润情况，PTEN突变和肿瘤微环境中的巨噬细胞，小胶质细胞以及中性粒细胞显著相关（P<0.05）。研究人员曾在胶质瘤研究中发现肿瘤相关巨噬细胞释放生长因子，细胞因子可以促进肿瘤的增殖，生存以及迁移。

研究是否PTEN突变和肿瘤微环境的组成结构相关，利用定量多重免疫荧光（quantitative multiplex immunofluorescence，qmIF），分析17个患者配对PD-1抑制剂治疗前后的FFPE（formalin-fixed paraffin embedded）染色样本，PTEN突变肿瘤有更高的CD68+巨噬细胞的浸润，但结果不显著，进一步细化分类，发现CD68+HLA-DR-的巨噬细胞在PTEN突变的样本中比例显著升高（P=0.011）。而免疫治疗后，PTEN野生型的样本中CD3+T细胞（CD8+/-）密度显著升高（P=0.0095），PTEN突变型样本中则不具有相关变化。

图7. 免疫治疗前后特殊标记细胞类型的比例

评估不同细胞类型间的聚集程度，利用空间统计方法，免疫治疗前PTEN突变样本中肿瘤细胞聚集更加紧密（P=2.4x10-4），而PTEN野生型样本中巨噬细胞在治疗后聚集程度更高（P=0.0012），在PTEN突变细胞中刚好得到相反的结果（P=0.032）。

总结

首先发现抗PD-1治疗有效的GBM患者总生存期更长，在本实验中，非反应组PTEN突变比例更高，RNA-seq证明PTEN突变可以诱导免疫抑制的肿瘤微环境，而这种免疫特征并非来源于传统意义上的Treg细胞，而是过表达CD44的肿瘤细胞，通常意味着更高的细胞活动性和GBM的侵袭性。组化分析证实在PTEN突变的肿瘤中T细胞浸润不足。通过空间统计分析发现PTEN突变的肿瘤细胞聚集程度更高，一定程度上可以阻止免疫细胞的浸润，有益于肿瘤细胞的存活。MAPK信号通路在以往的研究中和肿瘤免疫的不良预后相关，但是在一项临床前研究中表明MAPK通路的抑制可以提高免疫治疗的效果，在本队列中也是体现为MAPK通路中BRAF/PTPN11的突变在对抗PD-1治疗有效的患者组群众更显著。实际上也可能存在交联的调控网络，如在前列腺癌中存在的PTEN-PTPN11通路轴调控免疫抑制。

另外在本研究中也体现了GBM在免疫治疗过程中的进化特征，也证明免疫系统在肿瘤的发生过程中也起到了筛除高免疫原性表位的“肿瘤编辑”作用，同样在免疫治疗后也存在免疫抑制相关基因的高度活跃，从而促进肿瘤的免疫逃逸和存活。

编译作者

北京协和医院神经外科、北京协和医学院临床医学八年制2014级博士生 刘芃昊

本期编审

北京协和医院神经外科副主任医师王裕 副教授，医学博士、留美博士后

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