一文读懂丨外泌体在乳腺癌中的研究进展

作者：段勇威  赵自武  鲍腾飞  陈雅文  谢文

单位：武汉大学中南医院检验科

根据世界卫生组织的报告，癌症已经成为人类的头号杀手，而乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，是全球最常见的三大癌症之一。2012年，全世界将近1700万人被诊断为乳腺癌，且约有50万人死于这种疾病。

外泌体是一种细胞主动分泌的纳米级小囊泡，直径为30～120nm。最初，这种复杂的小囊泡结构在网织红细胞成熟过程中被发现，随后研究人员又陆续发现树突细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等不同种类的细胞都可释放出外泌体。外泌体并不是简单的细胞脱落碎片，其能运载细胞内源性蛋白质、核酸等生物信息分子，通过辨认、黏附、融合靶细胞，将携带的信息物质传递给靶细胞，进而影响靶细胞生物学活性。见图1。在肿瘤疾病中，外泌体与肿瘤的发生发展、肿瘤微环境的形成、促进血管生成及调节免疫反应等方面有着密切的联系，为肿瘤的早期诊断、疗效与预后评价，甚至治疗方法提供了一种新的思路。

图1 多囊泡内体与外泌体的分泌

外泌体可由乳腺癌细胞、基质和癌症相关成纤维细胞释放入细胞外环境及肿瘤微环境中，其在肿瘤细胞侵犯和转移、细胞凋亡、免疫细胞调节及耐药性等方面发挥着重要作用。本文将对外泌体在乳腺癌中所具有的作用进行综述。

01

外泌体参与乳腺癌的增生和凋亡

体外和体内实验均已证明外泌体在乳腺癌发展过程中起到显著作用。研究人员将乳腺癌细胞4T1所分泌的外泌体提纯、标记，在透射显微镜下观察到外泌体可以被携带CD133+与CD133-抗原的4T1细胞所吸收。同时，他们证实来源于4T1细胞的外泌体可以促进CD133+细胞的增生，而对CD133-细胞则无此效果。此外，这些外泌体可以明显抑制给予了凋亡激活剂阿霉素的CD133+4T1细胞的凋亡程度，而其对经过同样处理的CD133-4T1细胞则无作用。这种现象提示来源于肿瘤的外泌体不仅可以促进肿瘤增生，还能抑制CD133+肿瘤干细胞的凋亡，起到促癌因子的作用。

外泌体可通过其携带的非编码RNA调控乳腺癌细胞增殖，研究发现外泌体携带的长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）在促进乳腺癌细胞增殖方面起到重要作用，并且其表达量与乳腺癌进展程度密切相关。外泌体亦可影响免疫细胞的调控，CHATTERJEE等发现乳腺癌来源的外泌体可调控CD8+T细胞的增殖与分化，并抑制其对肿瘤细胞的杀伤功能，从而促进乳腺癌细胞免疫逃逸与增生。此外，乳腺癌基质细胞释放的外泌体可发挥促癌作用。脂肪细胞是乳腺癌组织中最丰富的基质细胞成分，近期相关研究发现脂肪细胞来源的外泌体可以被乳腺癌细胞MCF7吸收整合，其可通过激活Hippo信号通路促进MCF7细胞增殖和转移。

02

外泌体参与乳腺癌侵袭与转移

癌细胞转移是乳腺癌中较难解决的问题，乳腺癌的远端转移是患者的主要死因之一。癌细胞间质在肿瘤微环境中发挥着关键作用，然而目前对于间质影响癌细胞转移性的研究较少。LUGA等的研究显示，成纤维细胞分泌的外泌体通过与乳腺癌细胞（BCC）融合，并与癌细胞中的Wnt11建立联系进而激活PCP信号，由此调动肿瘤细胞里的自分泌Wnt-PCP信号，促进BCCs的转移。

外泌体除了调动信号通路，其还能携带非编码单链RNA（miRNA），促进不同种类细胞间的交流，从而达到传递生物信息的目的。研究证实，有数种miRNA参与了乳腺癌细胞的侵袭与转移，其中包括miR-9、miR-10b、miR-21、miR-29a、miR155、miR-200a、miR-374a等其他微小核糖核酸。SINGH等的研究显示，不同癌细胞株的外泌体miR-10b的水平存在明显不同。侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231的外泌体miR-10b水平显著高于不具有转移性的MCF-7细胞。更重要的是，非恶性乳腺上皮细胞通过吸收MDA-MB-231细胞分泌的携带miR-10b的外泌体，其细胞侵袭性被激活；这提示非侵袭性乳腺癌细胞可以通过获得来自于侵袭性癌细胞的外泌体而具有侵袭性。此外有研究表明，缺氧的肿瘤组织释放可携带miR-25-3p的外泌体，它可以激活乳腺癌细胞的活性和迁移能力，从而促进肿瘤的扩散和转移。

外泌体不仅可以转移侵袭性癌细胞的侵袭特征，其自身也具有破坏能力。ZHOU等的研究显示，携带着miR-105的外泌体可以攻击紧密连接蛋白ZO-1，破坏内皮细胞的结构完整性，从而造成阻止乳腺癌细胞转移的天然屏障受损。此外，研究还证实携带miR-105的外泌体还能够增加血管通透性，激活癌细胞在体内的转移活性，增强乳腺癌的散播能力。miRNA-105可在乳腺癌转移前期在血液循环中被发现，因此在临床上其既可以作为早期血源标记物，也可以当作乳腺癌靶向治疗的治疗靶点。

外泌体中的蛋白质对乳腺癌的侵袭与转移同样具有调节功能。HARRIS等利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术在MCF-7细胞、Rab27b细胞及MDA-MB-231细胞所分泌的外泌体中发现有85种蛋白存在差异表达。在这85种蛋白质中，有38种蛋白质在具有侵袭性的Rab27b细胞和MDA-MB-231细胞中表达上调超过两倍。其中多数蛋白质的功能与肿瘤发生、转移有关。更关键的是，38种蛋白质其中的30种可以作为潜在的、有待开发的肿瘤标志物应用于临床，以判断乳腺癌患者的预后。

外泌体蛋白组学分析显示膜联蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）是肿瘤来源外泌体高表达的一种蛋白。研究人员通过体内实验发现肿瘤来源外泌体可创造一种促进转移的微环境，而外泌体AnnexinⅡ在这一过程中发挥了关键作用。此外，乳腺癌患者血浆外泌体可通过其表面蛋白与乳腺癌细胞发生相互作用，并进一步激活黏着斑激酶（FAK）信号通路从而促进癌细胞的扩散。现阶段对外泌体内携带miRNA及蛋白质的检测还维持在基础研究阶段，但是随着对外泌体的认识加深，检验技术的日臻成熟，今后通过对乳腺癌外泌体提纯、分析，可以更全面地了解外泌体在乳腺癌进展中的作用，并从中探索乳腺癌治疗的靶点。

03

外泌体传递耐药性

化学药物治疗在乳腺癌的综合治疗中占有非常重要的地位，然而日益凸显的药物耐药性问题为乳腺癌的化学治疗设置了障碍。乳腺癌多药耐药（MDR）是乳腺癌患者化疗失败的主要原因之一。乳腺癌细胞通过诸如乳腺癌耐药蛋白（BCRP）这样的ＡTＰ结合盒（ABC）转运体而获得MDR。外泌体携带着ABC蛋白从具有MDR特性的癌细胞转移至药物敏感细胞中，从而在细胞间传播MDR特性。

阿霉素是一种治疗乳腺癌的最常用的抗癌药物。阿霉素敏感MCF-7细胞（MCF-7/S）可以吸收耐阿霉素MCF-7细胞（MCF-7/Adr）所分泌的外泌体。携带着大量的miRNA-222的外泌体使MCF-7/S转染上miRNA-222，从而使MCF-7/S从MCF-7/Adr获得部分阿霉素耐药性。外泌体所携带的miRNA可能介导乳腺癌细胞耐药。如SANTOS等发现，耐药乳腺癌细胞可通过外泌体将miR-155传递给药物敏感细胞，使其产生耐药表型并增强其迁移能力。MAO等学者的研究也证实了耐阿霉素MCF-7细胞外泌体可以通过传递miRNA，降低乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。同时研究人员还发现在耐阿霉素MCF-7细胞外泌体中含量最为丰富的前30个miRNA都与Wnt信号通路有着密切联系。Wnt信号通路在肿瘤细胞的转移、侵袭，甚至激发耐药性等方面具有重要意义。CHEN等同样发现耐多西他赛乳腺癌细胞分泌的外泌体可以通过上述相同的方式从耐药株细胞中转运特定miRNA至药物敏感性癌细胞，使药物敏感性癌细胞获得药物抗性。同时，研究人员使用GO与KEGG生物信息数据库分析发现，耐多西他赛乳腺癌细胞外泌体所携带的miRNA，诸如miR-24、miR-26a、miR-27a是通过影响MAPK信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等这些信号上调通路最终造成乳腺癌治疗的失败。此外，阿霉素耐药的人乳腺癌细胞释放的A/exo携带有丰富的泛素羧基末端水解酶-L1（UCH-L1），此类A/exo能以时间依赖性方式整合到对阿霉素敏感的人乳腺癌细胞中，并转移耐药表型。还有学者通过研究化疗前乳腺癌患者的血液样本中发现含有UCH-L1的外泌体水平与患者预后呈显著负相关。对外泌体所介导的乳腺癌药物耐受的研究，为后续对抗乳腺癌耐药、提高乳腺癌细胞药物敏感性及降低乳腺癌治疗失败率方面提供了新的研究方向与思路。

04

外泌体在乳腺癌中的诊疗价值

由于外泌体在乳腺癌的发生和发展过程中扮演重要的角色，并且肿瘤细胞来源外泌体携带着由肿瘤细胞释放的蛋白、核酸等物质，因此，对于成为一种新型乳腺癌诊断标志物，外泌体具有巨大的潜力。如MELO等发现75%的乳腺癌患者其外周血Glypi-can-1+外泌体水平显著高于健康对照者，因此Glypi-can-1+外泌体或可用于乳腺癌患者的鉴别。类似地，在早期乳腺癌患者中，其血浆外泌体中CD82蛋白水平与癌组织中CD82蛋白水平呈负相关，并且同健康对照组相比，患者外泌体CD82蛋白表达量显著升高，因此其可用于早期乳腺癌患者的诊断。HANNAFON等发现乳腺癌患者外周血外泌体包含的miR-21和miR-1246水平显著高于健康对照者，这提示外泌体miRNA谱亦可作为一种新的乳腺癌诊断策略。此外，外泌体来源的miR-222、miR-4443、miR-100、miR-17、miR-210被发现在耐药性乳腺癌患者血清中显著升高，该外泌体miRNA谱可用于化疗耐药与非耐药乳腺癌患者的鉴别。

外泌体作为内源性的纳米尺寸囊泡，其具有免疫原型和毒性较低的优点，在肿瘤治疗方面具有巨大的潜力，可作为药物递送的良好媒介。OHNO等发现外泌体可以有效地将let-7a传递给具有表皮生长因子受体的乳腺癌细胞并抑制其生长。LI等利用携带有Her2特异性抗原的树突状细胞外泌体与多克隆CD4+T细胞共同孵育，通过内化及膜融合作用使CD4+T细胞表达外泌体膜表面分子pMHC-I和CD80，从而使多克隆CD4+T细胞成为抗原特异性EXO-T疫苗，用于Her2阳性乳腺癌的治疗。此外，研究发现人类间充质干样细胞（MSC）来源的外泌体可作为良好的药物载体。NASERI等利用骨髓来源的MSC外泌体传递miR-142-3p抑制剂给乳腺癌细胞4T1和TUBO以及小鼠肿瘤模型，发现该外泌体可以穿透肿瘤部位，并将抑制性寡核苷酸传递到肿瘤细胞和组织中，从而显著下调miR-142-3p表达水平，抑制肿瘤细胞增殖。类似地，还有研究人员将携带有紫杉醇的MSC来源外泌体导入至高转移性MDA-hyb1乳腺癌小鼠肿瘤模型内，结果显示全身性应用MSC来源的外泌体使小鼠皮下原发性肿瘤细胞数降低了60%，使肺、肝、脾和肾中观察到的远处器官转移量减少了50%。外泌体在乳腺癌早期诊断、鉴别化疗耐药患者、药物递送及激活免疫细胞等方面都显示出巨大的潜在价值，随着对外泌体研究的深入，其临床诊疗价值将被进一步发掘。

总结与展望

外泌体被誉为有关细胞起源、生理与病理意义的“天然迷你地图”，其广泛参与了乳腺癌发生发展、侵袭转移及耐药等过程。外泌体不仅在机体体液中含量丰富，而且可保护自身所携带的带有特定表型的生物信号分子。因此，外泌体作为生物标记物在乳腺癌肿瘤诊治过程中可以得到广泛应用。除了在临床检测领域，外泌体在乳腺癌的治疗方面也有开创性的意义。外泌体在调节癌细胞的同时，还能够对自身的释放进行调节。细胞外环境中的外泌体能调节正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞外泌体的释放，正常乳腺上皮细胞外泌体还能抑制乳腺癌细胞外泌体的释放，这项发现为控制肿瘤外泌体带来的危害提供了新的治疗思路。另外，由于外泌体可以在癌细胞与正常细胞、癌细胞与癌细胞之间进行转移，其可用作良好的药物递送工具，这也为新型抗癌靶向药物的研发指明了新方向。

虽然外泌体在乳腺癌中所表现的生物特性及功能特点越来越清晰，但是将外泌体检测应用于临床诊断还存在一些困难。从机体采集来的外泌体起源于不同细胞种类，传统分析手段不足以辨别出外泌体的具体来源，探索一种高效、快速、经济确定外泌体来源的方法势在必行。关于乳腺癌外泌体的临床研究的报导仍然很少，目前，外泌体在黑色素瘤、结肠癌及肺癌的临床研究中已获得了一定进展。

2003年美国国立卫生研究院首次提出了“转化医学”的概念。转化医学将实验室研究与临床实践联系在了起来，加强了基础研究与临床沟通，促进实验室研究的成果向临床转化。乳腺癌是肿瘤研究最热门、最深入的领域之一，转化医学在很多乳腺癌的研究中得到了体现。随着对乳腺癌外泌体研究的不断深入，其在临床应用方面将会展现出良好的前景，针对外泌体的检测手段将更加精准、经济；针对外泌体的乳腺癌靶向治疗新方法也将趋于明朗，进一步的研究将为改善乳腺癌患者的预后带来新希望。

来源：肿瘤医学论坛  整理自：国际检验医学杂志2020年9月第41卷第17期

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