同济大学杜建忠教授课题组：自荧光多肽基囊泡将抗菌过程可视化

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荧光成像是广泛应用的生物成像技术之一。高分子囊泡可包载荧光染料，从而实现荧光成像，但存在染料泄漏等问题。针对该问题，同济大学高分子材料系杜建忠教授课题组在不引入任何外源荧光分子的情况下，构建了一种自发蓝色荧光的多肽基抗菌囊泡，并实现了抗菌过程的可视化。

研究思路如图1所示。首先设计并合成了嵌段共聚物PCL₂₅-b-PTrp₂-b-P(Lys₁₃-stat-Phe₄)，然后自组装形成囊泡。其中，具有良好生物相容性和生物可降解的PCL链形成囊泡膜，抗菌肽[P(Lys-stat-Phe)]形成囊泡冠，可提供正电荷和疏水效应，以实现广谱抗菌活性。同时，芳香族氨基酸在自组装过程中的苯环叠加和氢键的形成会诱导电子离域效应，使囊泡的自荧光从氨基酸的不可见紫外波段红移至可见的蓝光波段。利用囊泡的蓝色荧光，结合激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)，对囊泡与细菌的相互作用进行了实时观测，证实了囊泡特异性粘附细菌、引发膜破坏和细菌死亡的过程。图1  蓝色自荧光囊泡的合成及抗菌过程可视化示意图

图2  自荧光多肽基囊泡的结构和性能表征：(a) 囊泡的动态光散射结果; (b) 囊泡的透射电镜照片; (c) 囊泡的降解性能; (d) 色氨酸与囊泡的荧光图谱对比

透射电镜照片（图2b）证明了囊泡结构，动态光散射研究表明囊泡直径为372 nm（图2a）。将胰蛋白酶与囊泡共孵育48 h后，囊泡降解了95%以上，表明该囊泡具有良好的生物可降解性（图2c）。荧光图谱（图2d）表明，色氨酸在354 nm处具有最强的荧光信号，而经过聚合与组装后形成的囊泡的荧光红移至蓝色可见波段（最大荧光发射波长436 nm）。采用96孔板法测定了自发荧光多肽基囊泡的抗菌性能，证明其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌皆有明显的抗菌效果(图3)。进一步利用LIVE/DEADTM BacLightTM细菌活死染色试剂盒检测了囊泡的抗菌活性(图4)。膜结构完整的活细菌被染成绿色，而膜受损的死细菌被染成红色。在囊泡处理前，几乎所有的细菌均是存活状态(图4a)。而囊泡处理4 h后，大部分细菌死亡并呈现明显的红色荧光(图4b)，验证了囊泡可有效杀灭细菌。图3  自荧光囊泡的抗菌性能

图4  LIVE/DEAD^TM BacLight^TM细菌活死染色试剂盒处理后大肠杆菌与囊泡共孵育(a) 0 h与(b) 4 h后的荧光图像

随后，基于囊泡的自发蓝色荧光特性，利用激光扫描共聚焦显微镜，开展了抗菌过程的可视化研究(图5)。为了清晰地展现细菌膜结构，使用尼罗红(亲脂性细胞膜染色剂)对细菌细胞膜进行染色。多肽基囊泡处理细菌后，细菌显示了蓝色和红色两种荧光(图5b)，表明囊泡对细菌具有选择性靶向能力，该现象可归因于带正电的囊泡(zeta电位为+56mV)与带负电的细菌膜之间的静电相互作用。同时，从细菌膜上观察到不连续的红色荧光(图5b)，这是囊泡刺入细菌的细胞膜并破坏了细胞膜完整性所造成。综上，他们构建的自荧光多肽基囊泡既能高效杀菌，又能实现抗菌过程的可视化，为生物医学研究领域提供了一种新型的生物成像方法。

图5 尼罗红染色后大肠杆菌与囊泡共孵育(a) 0 h与(b) 4 h后的荧光图像

该工作以“Biodegradable Polypeptide-based Vesicles with Intrinsic Blue Fluorescence for Antibacterial Visualization”为题发表在Chinese Journal of Polymer Science上(DOI:10.1007/s10118-021-2593-0)。同济大学硕士研究生杨雨嬴是该论文的第一作者，范震研究员与杜建忠教授为通讯作者。该项工作得到了国家自然科学基金等资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s10118-021-2593-0

来源：高分子科学

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