东华大学史向阳教授团队 AM：具有免疫调节功能的含磷树冠大分子载药纳米胶束通过协同调节多种免疫细胞增强肿瘤化学免疫治疗

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近年来，免疫治疗作为一种新的治疗策略得到迅速的发展。其中部分化疗药物（如紫杉醇、阿霉素或奥沙利铂）通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD），释放肿瘤抗原和危险相关分子模式激活抗原，产生抗原特异性的免疫反应。尽管如此，由于高剂量的化疗药物存在药物副作用大、治疗效果差和易被内皮网状系统清除等缺陷，肿瘤免疫微环境（TME）参与了免疫抑制的不同机制来逃避免疫监视，单用化疗产生的免疫调节效应仍难以产生强烈的抗肿瘤免疫反应。因此，开发一种有效协同调节多种免疫细胞的纳米药物以增强抗癌免疫治疗至关重要。

以NK细胞为基础的免疫疗法具有明显的优势，如细胞识别时不受抗原特异性控制同时充当免疫系统的调节细胞，释放穿孔素和颗粒酶等杀死异常细胞来调节先天性和获得性免疫反应。此外，米托蒽酮、DOX、顺铂等化疗药物在增强NK细胞的敏感性和提高其细胞毒性方面具有一定的潜力。例如，DOX已被证明能够通过上调肿瘤细胞中的TRAIL受体和下调细胞内的FLICE抑制蛋白来增强NK细胞的靶向性，并促进由Caspase-8裂解触发的凋亡信号。

在众多的纳米载体体系中，含磷树状大分子和PAMAM树状大分子具有显著的不同之处，具有分子量均一、较强的刚性结构、自身的药物活性等特性。例如，含磷树状大分子与金属络合物可以用于抗肿瘤治疗应用，修饰磷酯酸钠盐的含磷树状大分子可以抑制外周血单核细胞（PBMC）中调节性T细胞（Tregs）的扩增并调节单核细胞和NK细胞之间的复杂信号诱导NK细胞增殖用于肿瘤的治疗。

由于含磷树状大分子具有的刚性结构使其难以物理封装化疗药物，两亲性含磷树冠大分子的发展解决了这一难题，可通过在水溶液中自组装形成胶束用于封装药物。考虑到复杂的肿瘤微环境仍然是免疫细胞发挥有效抗肿瘤细胞活性的主要障碍，而针对PD-1/PD-L1的“免疫检查点阻断”（ICB）疗法可通过抑制肿瘤细胞表面PD-L1的表达逆转CD8+ T和NK细胞的衰竭，从而解除免疫抑制，恢复抗肿瘤免疫。因此，基于磷酯酸钠盐含磷树冠大分子的免疫调节活性，并联合肿瘤ICD和ICB疗法有望重塑肿瘤免疫微环境并产生抗肿瘤免疫记忆效应。 

为解决以上问题，东华大学史向阳教授团队联合法国国家科研中心配合物化学实验室Jean-Pierre Majoral院士团队制备了一种基于免疫调节性含磷树冠大分子胶束的纳米药物，通过协同调节多种免疫细胞（如NK细胞、DC细胞和T细胞）增强肿瘤化学免疫治疗（图1）。研究团队首先通过发散法合成了以亚磷酸钠盐（M-G1-TBPNa，TBP表示含有两个二甲基磷酸的酪胺）封端的第1代两亲性含磷树冠大分子。该树冠大分子能够在水溶液中形成胶束有效包封化疗药物DOX。制备的纳米药物一方面通过DOX介导的化疗促使肿瘤细胞凋亡，诱导强烈的ICD效应激活系统免疫和CD8+ T细胞的浸润；另一方面，利用胶束自身的免疫调节活性，通过血液循环刺激PMBC中NK细胞的特异性增殖，到达肿瘤部位发挥杀伤作用；此外，通过联合ICB疗法，M-G1-TBPNa@DOX纳米药物可产生增强的抗肿瘤免疫反应以及免疫记忆效应，从而实现高效的抗肿瘤转移治疗。

图1. M-G1-TBPNa@DOX的合成及应用示意图。

研究团队首先通过TEM、AFM、粒径和电势变化证明了M-G1-TBPNa@DOX的成功合成（图2A-F）。M-G1-TBPNa@DOX在480 nm处出现DOX的特征吸收峰进一步证明纳米药物的成功制备（图2G），其在水、PBS以及培养基中具有良好的胶体稳定性（图2H）。

图2.（A）M-G1-TBPNa和（B）M-G1-TBPNa@DOX的TEM图；（C）M-G1-TBPN和（D）M-G1-TBPNa@DOX的AFM图；各材料的水合粒径（E），电势（F）及紫外吸收曲线（G）；（H）M-G1-TBPNa@DOX在水、PBS以及培养基中的粒径变化曲线。

研究团队通过细胞吞噬实验证明，小鼠黑色素瘤细胞B16细胞对M-G1-TBPNa@DOX的摄取呈浓度依赖性，其对M-G1-TBPNa@DOX的摄取程度大于DOX（图3A-B），因而M-G1-TBPNa@DOX显示出增强的促肿瘤细胞凋亡能力，促使促凋亡蛋白Bax、p53及PTEN上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调（图3C-E）。此外，通过Transwell实验证明，M-G1-TBPNa@DOX可引起肿瘤细胞CRT外翻，刺激HMGB-1和ATP释放，从而在体外诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡，刺激树突细胞熟化（图3F-J）。

图3.（A）不同材料处理后B16细胞内的荧光强度；（B）不同浓度的M-G1-TBPNa@DOX处理后B16细胞的激光共聚焦图；（C-D）不同材料处理后B16细胞的凋亡情况流式分析及（E）凋亡相关蛋白的Western blot试验结果图；（F）各组材料与B16细胞共孵育后，（F）CRT的表达，（G）HMGB-1的释放，（H）ATP的分泌情况分析图；（I-J）各组材料刺激DCs熟化的分析图。对于（C-J）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，M-G1-TBPNa；Ⅲ，free DOX；Ⅳ，M-G1-TBPNa@DOX；V，LPS。

随后，团队研究了M-G1-TBPNa@DOX对PBMCs中NK细胞增殖的影响及其体外抗肿瘤能力。实验结果表明，制备的纳米药物可使PBMCs中NK细胞扩增13.7%（图4A-C），进一步研究发现，处理后的PBMCs中释放出更多的细胞因子IFN-γ，表达更高水平的穿孔素和颗粒酶B以更好地杀伤肿瘤细胞（图4D-F）。此外，M-G1-TBPNa@DOX处理后的PBMCs与B16细胞共孵育后促进了肿瘤细胞中凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达，促进了细胞凋亡（图4G-I）。

图4.（A）B16细胞与不同材料处理后的PBMCs共孵育的示意图；不同材料处理下PBMCs中（B-C）NK细胞的比例分析，（D）IFN-γ的含量，（E）穿孔素的表达及（F）颗粒酶B的表达情况分析；B16细胞与不同材料处理后的PBMCs共孵育后，B16细胞的（G）细胞凋亡结果，（H）相关凋亡蛋白的Western blot试验结果图及（I）caspase-3的表达情况。对于（B-I）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，IL-2；Ⅲ，IL-2+M-G1-TBPNa；Ⅳ，IL-2+M-G1-TBPNa@DOX。

研究团队在小鼠体内构建B16皮下瘤模型，通过体外荧光成像验证了M-G1-TBPNa@DOX可被动靶向到肿瘤区域并具有延长的血液循环时间。在体内抗肿瘤实验中，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1（PD-L1抗体）取得最佳的肿瘤抑制效果，M-G1-TBPNa@DOX可诱导肿瘤细胞发生ICD，分泌相关细胞因子熟化树突细胞（图A-F）。同时aPD-L1阻断了免疫检查点，恢复了T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，经流式分析，联合治疗后小鼠脾脏和肿瘤部位的CD4+和CD8+T细胞的比例显著升高，肿瘤部位Tregs下调（图5G-L）。同时，M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1的联合治疗使得PBMCs、肿瘤、脾脏部位NK细胞的比例上升，这充分表明肿瘤免疫抑制微环境被逆转，联合治疗引起了最有效的系统免疫应答。

图5.（A）小鼠肿瘤部位CRT的分布；（B-C）淋巴结的树突细胞熟化情况结果分析图；血清中（D）IL-6、（E）IL-12p70、（F）TNF-α的表达水平；（G-I）肿瘤部位CD4+和CD8+T细胞的分布情况；（J）CD8+/CD4+ T细胞的比例；（K）肿瘤部位Tregs的表达水平分析；（L）CD8+T细胞与Tregs的比值。

随后，研究团队进一步评估了M-G1-TBPNa@DOX+aPD-L1的联合疗法在体内产生的长期免疫记忆效应，在联合治疗的基础上进行了抗肿瘤转移实验（图6A）。研究发现联合治疗使小鼠脾脏和淋巴结中的记忆T细胞含量显著增加（图6B-F），并且抑制了肿瘤的肺转移情况（图6G-I）。

图6.（A）小鼠体内抗肿瘤转移实验示意图。（B）脾脏部位、（C）淋巴结部位的记忆T细胞比例分析。（D）脾脏部位中央记忆T细胞和（E）效应记忆T细胞比例分析；（F）IFN-γ的表达情况；（G-I）各组小鼠经治疗后抗肿瘤转移实验结果。

简而言之，该研究设计的M-G1-TBPNa@DOX纳米药物具有以下优势：1）构建的纳米药物胶束显著提高了DOX的生物利用度并降低了其副作用，DOX介导的化疗作用促进了肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞发生ICD，激活免疫系统；2）纳米胶束固有的免疫调节活性促使PBMCs中的NK细胞增殖，通过血液循环作用被招募到肿瘤部位，协同其余免疫细胞发挥抗肿瘤功能；3）M-G1-TBPNa@DOX与aPD-L1的联合治疗有效产生长期免疫应答并抑制肿瘤转移。本研究制备的M-G1-TBPNa@DOX为协同调节多种免疫细胞以实现增强的抗肿瘤化学免疫治疗提供了新思路。

以上研究成果以“Phosphorous Dendron Micelles as a Nanomedicine Platform for Cooperative Tumor Chemoimmunotherapy via Synergistic Modulation of Immune Cells”为题，在线发表于国际著名期刊Advanced Materials (DOI: 10.1002/adma.202208277)。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授为通讯作者，博士研究生詹梦偲为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委、上海市科委及上海市领军人才计划等项目的资助。

文章链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202208277

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