【Cell Stem Cell】AD细胞疗法！王建枝团队揭示pTau蛋白异常聚积破坏海马神经发生的微环境机制

Alzheimer's disease

痴呆症是一种表现为记忆、思考、行为和日常活动能力衰退的综合征。世界卫生组织资料显示，全世界大约有5000万痴呆症患者，每年新增病例1000万。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种与年龄相关的慢性中枢神经退行性疾病，是痴呆症最常见的形式，约占痴呆症病例的60-70%。中国痴呆患者人数居世界第一，据估计约有950万，到2030年中国痴呆患者将会达到1600万。AD主要的病理特征包括淀粉样蛋白聚集形成的老年斑(Senile plaques, SPs)、Tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结 (Neurofibrillary tangles, NFTs)以及大量神经元丢失。AD病程进展缓慢，早期症状常被认为是普通的健忘而被忽视。AD患者晚期认知功能能力逐渐丧失，伴随人格异常以及各种行为功能障碍，最终导致死亡。

海马是大脑中与学习记忆密切相关的结构，同时也是成年海马神经发生（adult hippocampal neurogenesis，AHN）的重要区域。在AD患者脑中，存在着大量神经元死亡和突触丢失的现象。基于此，有研究通过促进海马神经新生或体外移植干细胞来修复或重建AD患者脑部退变的神经网络，这为预防和治疗AD带来了新希望[1-2]。然而，AD脑内的病理因素是如何影响神经新生的尚未完全阐明。因此，弄清楚AD脑内哪些因素，如何影响神经元新生是AD细胞疗法应用的基础。

2020年3月5日，华中科技大学同济医学院王建枝教授团队在《Cell Stem Cell》杂志发表题为“Interneuron Accumulation of Phosphorylated Tau Impairs Adult Hippocampal Neurogenesis by Suppressing GABAergic Transmission”的最新研究工作[3]，该研究发现，中间能神经元内Tau蛋白聚集抑制了海马DG区局部神经环路内GABA能信号的传递，引起神经干细胞源性的星形胶质细胞增生增多，神经元新生减少，从而破坏了成年海马神经发生。而增强GABA能信号传导，可促进AD模型鼠内源性的海马神经元新生，并改善其认知功能。这为干预海马GABA能神经元调控海马神经新生在AD细胞疗法提供了理论基础。

这项研究创新性地揭示了AD患者脑内失衡的微环境已不利于神经干细胞正常增殖、分化为新生神经元。因此，直接增加内源性神经干细胞数目或直接移植神经干细胞（或多能干细胞）可能并不能很好地在AD脑内诱导神经元的新生。同时，也给出了细胞治疗新策略：移植人工指定分化方向的神经前体细胞，以及在干细胞移植的同时辅以一些能够调节神经突触传递效能（如加波沙朵）或具有神经营养功能（如BDNF）的药物，可以获得到更好的治疗效果。

基于这项研究潜在的临床价值，美国加州大学旧金山分校黄亚东教授在同期杂志发表专题评述（Cell Stem Cell. 2020. 26(3):297-299），对本论文的研究发现及其重要意义进行了介绍。

图引自同期刊发的评述文章R Najm, A Rao, Y Huang. Cell Stem Cell. 2020.  26(3):297-299

结果

PART

1

AD患者和模型鼠海马DG区GABA神经元pTau聚集

首先，作者发现在AD患者和3xTg小鼠海马齿状回颗粒细胞下层（the subgranular cell zone, SGZ）和门区（hilus of dentate gyrus）均出现磷酸化Tau蛋白（pTau）在GABA能中间神经元内聚集的现象（图1）。

图1 AD患者和小鼠海马齿状回GABA能中间神经元内pTau聚集

PART

2

GABA神经元过表达hTau导致AHN缺陷

随后，研究人员分别在Dlx5/6-CIE、PV-Cre和SST-Cre小鼠海马DG区注射AAV-EF1a-DIO-hTau-mCherry和ROV-GFP（图2A-D）。结果显示，DG区细胞增殖降低、未成熟的颗粒细胞（granular cells, GCs）数量减少，此外，逆转录病毒标记上的新生神经元树突长度、密度及复杂度均下降（图2E-H），这提示了在海马DG区GABA能中间神经元选择性过表达人源Tau蛋白（hTau）可导致海马神经发生（adult hippocampal neurogenesis, AHN）缺陷。同时，在PV中间能和SST中间能神经元上特异性过表达hTau也会导致AHN缺陷（图2I,J）。

图2 中间能神经元特异性过表达hTau可导致AHN缺陷

PART

3

hTau蛋白聚集诱导NSC源性的星形胶质细胞增生

进一步，作者构建Dlx5/6-CIE：Nes-GFP小鼠，发现特异性在中间能神经元过表达hTau会导致神经干细胞（neural stem cells, NSCs）形态学改变（图3A-E）。此外，借助荧光激活细胞分选术(FACS)和qPCR技术还发现静息态NSCs被激活，并产生星形胶质细胞（图3F,G）。

为进一步探究NSC分化情况，研究人员在Dlx5/6-CIE小鼠脑部注射AAV-EF1a-DIO-hTau-mCherry，当hTau表达充分后，在海马DG区注射ROV-GFP病毒载体以标记新生神经元。结果发现，大多数GFP+细胞分化为星形胶质样细胞，并表达GFAP蛋白（图3H-J）。值得注意的是，大部分GFP/GFAP双标记细胞倾向于向DG区分子层(ML)迁移（图3I），这与在中间能神经元过表达hTau蛋白的小鼠DG ML中观察到的GFAP免疫阳性细胞数量增加结果一致（图3K）。

这些数据提示了，GABA能中间神经元特异性过表达hTau导致神经干细胞源性的星形胶质细胞增生增多。

图3 GABA能中间神经元特异性过表达hTau导致神经干细胞源性的星形胶质细胞增生增多

为研究hTau过表达导致的AHN缺陷以及NSC源性星形胶质细胞增生增多的神经生物学机制，作者借助蛋白组学分析发现，中间能神经元过表达hTau导致蛋白表达或磷酸化变化显著，此外，在涉及谷氨酸能或GABA能突触传递的生物学过程中，蛋白的表达或磷酸化最为丰富（图4A-C）。

随后，研究人员借助在体电生理技术记录了小鼠SGZ神经元发放情况，结果显示，GABA能中间神经元过表达hTau蛋白导致神经元整体发放频率及局部场电位（LFP）的功率谱密度（PSD）增加（图4D-I）。

接下来，研究人员将AAV-CaMKIIa-GCaMP6f定位注射于小鼠海马DG区，以检测钙离子浓度变化（图4J），结果发现，中间能神经元过表达hTau显著增强海马DG区钙离子活动，提示了邻近兴奋性神经元过度激活（图4K,L）。

图4 GABA能中间神经元hTau过表达破坏突触传递，诱导局部神经网络过度激活

进一步，作者借助DREADDs技术慢性抑制海马DG区兴奋性神经元，将AAV-EF1a-DIO-hTau- mCherry和AAV-CaMKIIa-hM4Di-FLAG混合注射Dlx5/6-CIE：Nes-GFP小鼠和Dlx5/6-CIE小鼠DG区，并将CNO通过饮用水连续6周给药（图5A,B）。结果发现，化学遗传学抑制兴奋性神经元可显著改善由中间能神经元过表达hTau蛋白引起的NSC异常和AHN缺陷，表现为BrdU和DCX阳性细胞数增加，以及Dlx5/6-CIE小鼠注射ROV-GFP后标记新生神经元树突棘密度及复杂度增加（图C-H）。值得注意的是，化学遗传学抑制兴奋性神经元并未明显改变部分ROV-GFP标记新生GCs和ML GAFP阳性星形胶质细胞的数量（图5I,J），这可能是由于hTau蛋白过表达导致GABA能中间神经元直接向NSCs、中间祖细胞（IPCs）、未成熟的GCs输入的GABA能信号不足所致。

以上数据提示了，中间神经元hTau蛋白聚积诱导的GABA能信号传递受阻和神经网络过度激活是造成AHN缺陷的主要原因，而借助化学遗传学去抑制局部兴奋性神经元的活动可部分改善这一现象（图5K）。

图5 抑制神经网络过度激活可改善中间神经元hTau蛋白聚积引起的AHN缺陷

之前有研究报道，Tau蛋白过度聚积会导致海马GABA能信号异常[4]。因此，为探讨hTau诱导的神经网络过度激活是否是由GABA能信号传导损伤所致，作者借助iGABASnFR探针监测GABA能神经递质释放情况（图6A-C）。结果发现，特异性在中间能神经元过表达hTau蛋白可显著减弱GABA神经递质释放量和海马DG区胞内GABA水平（图6D-G）。

PART

4

GABA 受体激动剂可改善AHN缺陷及认知功能障碍

为进一步探究其分子机制，研究人员检测了参与GABA代谢的关键蛋白表达情况，发现在hTau过表达小鼠体内GAT1蛋白（GABA转运蛋白）表达下调（图6H,I），然而，GAT1下降可能并不是GABA信号传递减弱的原因。此外，研究还发现，中间能神经元过表达hTau会显著下调GAD67磷酸化水平，而不改变GAD65磷酸化水平（图6J），这两种酶均为催化合成GABA的关键限速酶[5]，这提示了，GAD67磷酸化（pGAD67）水平降低可能会导致GABA合成异常，最终导致GABA含量减少。同时，利用GABA 受体激动剂——加波沙朵（gaboxadol, THIP）能显著改善AHN缺陷，表现为BrdU和DCX阳性细胞数量上升，新生GCs树突长度及树突棘复杂度增加，以及ML DG区GFAP阳性星形胶质细胞数量下降（图6K,L）。

图6 hTau聚积诱导的AHN由GABA能信号传导受损所致

最后，作者在6月龄的3xTg AD模型鼠上做进一步验证，该小鼠海马DG区已可以明显观察到pTau过度聚积，且局部GABA能信号传导减弱的现象（图1D-G,图7A-B）。结果显示，皮下注射THIP可改善AHN缺陷（图7C,D）。此外，根据行为学试验范式结果，THIP逆转3xTg AD小鼠与环境相关的学习和记忆能力（图7E-J）。

综上，提示了通过预先给药THIP可增强GABA能神经信号传导，促进AD模型小鼠内源性的海马神经元新生，从而有效地减少AHN缺陷，并改善环境相关的认知功能。

图7 THIP可缓解3xTg AD的AHN缺陷，并改善环境相关的认知功能障碍

结论

文中王建枝教授团队借助病毒载体介导的在Cre鼠上特异性过表达、逆转录病毒标记新生神经元、化学遗传学、分子生物学技术、行为学试验等技术手段发现，AD患者和模型鼠海马DG区GABA神经元pTau聚集，而pTau聚集引起NSC源性的星形胶质细胞增生增多，神经元新生减少，导致海马DG区局部神经环路内GABA能信号的传递受阻及局部神经网络过度激活，从而导致AHN缺陷。同时通过化学遗传抑制兴奋性神经元或借助受体激活剂增强GABA能信号传导，可促进AD模型鼠内源性的海马神经元新生，缓解AHN缺陷并改善其认知功能。

本论文的共同第一作者是基础医学院郑杰博士后和李宏莲博士，共同通讯作者是郑杰和王建枝教授。这项工作得到了中国国家重点研发项目的部分支持(2016 YFC1305800 to J-Z.W);国家自然科学基金支持 (31730035，91632305, 81721005, 91949205to J-Z.W；81901107,to J.Z)

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参考文献：

[1] Choi, S.H., et al. (2018). Combined adult neurogenesis and BDNF mimic exercise effects on cognition in an Alzheimer’s mouse model. Science 361, eaan8821.

[2] Hunsberger, J.G., et al. (2016). Accelerating stem cell trials for Alzheimer’s disease. Lancet Neurol. 15, 219–230.

[3] J, Z., et al.（2020） Interneuron Accumulation of Phosphorylated Tau Impairs Adult Hippocampal Neurogenesis by Suppressing GABAergic Transmission. Cell stem cell. DOI:https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.12.015.

[4] Li, X., et al. (2017). Correcting miR92a-vGAT-mediated GABAergic dysfunctions rescues human Tau-induced anxiety in mice. Mol. Ther. 25, 140–152.

[5] Fenalti, G., et al. (2007). GABA production by glutamic acid decarboxylase is regulated by a dynamic catalytic loop. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 280–286.