单分子磁镊测量Lambda DNA的拉伸曲线
物理生物学是一个不断发展的交叉领域。这个领域关注的核心内容是定量的数据需要定量模型来分析，同时定量模型也需要为可被实验检测的现象做出预测[1]。一方面，物理建模可以用来理解定量的生物数据；另一方面，物理模型与生物实验之间可以相互促进。近年来，单分子技术的快速发展大大推动了物理生物学的发展。与传统的生物实验是对于众多分子活动的集群平均不同，单分子技术关注的是单个分子的行为[2]。因此，单分子技术可以直接对生命活动的中间态以及其分布进行定量测量，提供动力学过程的信息。而且单分子技术可以用来观测分子结构对于力学等操纵手段的响应。
单分子操纵是一种新型的实验技术[3,4]，具体包括光镊[5]、磁镊[6]和原子力显微镜[7]等。近年来该技术发展迅速，科学家们借助该技术取得了丰富的成果，如MeCP2蛋白组装的染色质纤维结构[8]、人类端粒处多G-quadruplex(G4)系统的稳定性和折叠动力学[8]、大肠杆菌单链结合蛋白的结合性质[9]等方面的研究。磁镊是单分子操纵技术的一种，它是通过外加磁场操纵磁性微粒，从而操纵与磁性微粒连接的生物大分子，研究单个分子的力学性质，具有作用力强，操作方便，对生物大分子无损伤等优点。一套完整的磁镊装置主要包括外磁场、显微设备和数据采集处理设备。相比其他的单分子操纵技术，磁镊可以施加大小合适的恒力，可以定量改变生物大分子的形变。因此，单分子磁镊技术应用非常广泛。
目前我国本科阶段的物理教学对于物理生物学的涉及并不多，物理实验教学在这方面尤为欠缺。基于此现状，笔者经过总结和思考，对一个操作难度适中的磁镊实验——“单分子磁镊测量Lambda DNA的拉伸曲线”进行了有益的讨论，力求通过本文为高校开展单分子磁镊实验提供参考，使本科生初步接触物理生物学，了解如何用物理思想解决生物学问题；使本科生接触先进的单分子磁镊技术，体验从样品池修饰、连接反应底物、显微镜观察到数据采集及处理的完整实验过程，弥补物理生物学实验教学方面的欠缺。
1 实验原理
本实验是基于DNA分子具有一定的弹性[10,11]。DNA分子一般为双链结构，每条链由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。每条链相邻碱基间的堆积力和磷酸负电性导致的相邻磷酸之间的排斥力使DNA趋向于形成直杆；另一方面，在DNA所处的环境中存在kBT(kB为玻尔兹曼常数，T为热力学温度)级别的热扰动，这种热扰动使DNA倾向于弯曲成团状。由此可见DNA分子具有一定的弹性。如果用外力去拉DNA分子，将会使其更趋向于形成直杆，两端长度会增加。对于DNA这类长聚合物，通常用持久长度A对其刚度进行量化，长度小于该力学量的长聚合物可视为弹性棒，而长度大于该力学量的聚合物则倾向于三维随机游动。在DNA所处的溶液环境和温度一定时A为一常数；而沿着DNA轮廓的长度为DNA轮廓长度，记作L0，对于一种确定的DNA，L0为常数；将DNA两个端点之间的距离命名为首末端距，记作L。当施加的外力F不同时，L会随之变化。
本实验主要利用抗原-抗体相互作用来实现DNA的固定。采用外径为1mm的方形毛细管作为样品池，对样品池内壁进行清洗和硅烷化修饰(硅烷化修饰是用有机硅烷水溶液对样品池内壁进行表面处理的过程，其作用是屏蔽外界活性基团的影响)，并连接上地高辛抗体；在Lambda DNA两端分别修饰有地高辛和生物素，这样连接有地高辛的一端即可与样品池内壁相连并固定；向样品池注入表面有生物素抗体的磁球，磁球将会连接到DNA修饰有生物素的一端,如图1所示。磁球在磁铁产生的磁场中受力，通过改变磁铁与磁球间的距离，可以改变磁球的受力，从而实现对Lambda DNA的连续拉伸。
图1 DNA两端加力的方法
2 实验部分
2.1 实验装置
本实验的装置主要包括样品池、处理设备以及观察装置(带横向磁镊的显微镜、CCD相机和搭载相关软件的计算机)。实验中所使用的磁镊为一对永磁体，磁镊方向沿水平方向(即横向)，显微镜镜头方向(即垂直地面方向)为纵向(见图2)。所使用的化学试剂及仪器清单见附录1。
图2 样品池及磁镊
2.2 实验步骤
实验中利用丙酮和甲醇对毛细管壁进行清洗，再利用浓硫酸过氧化氢混合液、APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)及戊二醛对管壁进行修饰，使其能够连接上地高辛抗体(具体步骤见附录2)。
将修饰完成的毛细管组装到样品架，取3～4cm软管连接到出样口和进样口，用凡士林密封。样品架的结构如图3所示。
图3 样品架结构
样品池组装完成后，向进样口注入稀释后的地高辛抗体，并用钝化液钝化管壁。将Lambda DNA与磁球稀释液注入离心管使其相连，待其充分连接后注入样品池使Lambda DNA-磁球连接体与管壁上的地高辛抗体进行连接，洗去游离磁球和DNA(具体步骤见附录3)。本实验所用Lambda DNA为λ噬菌体的DNA，其结构就是上文提到的经典的DNA双链结构。
得到处理完毕的样品池后，打开计算机的Image J软件，旋转对焦旋钮直至屏幕中出现磁球颗粒的图像(如图4)。轻轻挤压软管确定磁球的连接状态，选取单根DNA连接的磁球。由于单根DNA的全长近似16μm，磁球的直径为2.8μm，单根连接的磁球摆动的最远距离应该约为35μm。如果磁球摆动的最远距离明显小于35μm，说明有可能是多跟DNA连接的磁球，不是本实验的研究对象。用黑色标志追踪磁球位置(如图4)。调节磁镊逐渐靠近毛细管，观察画面中与DNA连接的磁球的运动状态变化。当磁镊距离毛细管较远时，能观察到磁球具有明显的热涨落；当磁镊接近，磁球受力增大，磁球的热涨落明显减小。视野中部分磁球未观察到涨落，说明这些磁球固定于管壁。
图4 磁球图像
(图中黑色标记代表对磁球的定位和追踪)
实验中利用Image J软件追踪磁球位置，通过改变磁镊与毛细管的距离来改变对磁球施力的大小。首先将磁镊置于较远的位置，由于磁球的布朗运动，其位置具有一定的涨落。用Image J获得磁球在DNA伸展方向的位置y和垂直于DNA伸展方向的位置x，从而得到DNA首末端距L及x方向上的涨落。将磁镊逐渐靠近毛细管，改变磁球的受力，同样方法采集数据。最终得到不同受力情况下的磁球涨落数据。
3 实验数据处理及分析
生物大分子在不同的拉力范围内有不同的弹性性质。对于DNA这种具有局部弯曲弹性的大分子，在0.1到几十pN的拉力范围内，描述双链DNA响应拉伸力的最好模型是蠕虫模型，即WLC模型[1]：
(1)
式中，kB是玻尔兹曼常量；T是热力学温度；A为DNA的持久长度，在0.2mmol/L PB(磷酸盐缓冲液)+140mmol/L NaCl溶液中，DNA的持久长度A为50nm左右；L0是DNA的轮廓长度，Lambda DNA的L0约为16.4μm；L是DNA的首末端距，为待测量；F是可控大小的外力，可根据DNA长度及磁球布朗运动导致的位置涨落算出：
(2)
式中，kB为玻尔兹曼常数；T为热力学温度；(Δx)2为磁球位置涨落的方差。实验中利用磁球位置确定L，根据公式(2)求出F，即可作出F对
根据式(2)，我们可以由L和x方向上的涨落算出Lambda DNA受力，如表1。
表1 磁球横向涨落、纵向位置及计算所得的L/L0和Lambda DNA受力大小
续表
根据式(1)拟合蠕虫链模型的曲线，将实验得到的数据与蠕虫模型进行比对。如图5：
图5 Lambda DNA拉伸理论的蠕虫链模型拟合
通过图像我们可以看出，实验所得到的L/L0及其对应的Lambda DNA受力大小之间的关系大致符合蠕虫链模型。蠕虫链模型同时考虑了链状高分子的弯曲能和熵，体现了两者之间的竞争，两者对总自由能的贡献都很重要。当DNA不断被拉伸，分子可具有的构型数目将会不断地下降，因此熵随之减少，发生熵形变。蠕虫链模型从物理学角度形象地刻画了DNA在热扰动作用下的弹性性质。
4 实验的限制及改进措施
本实验的限制主要有以下几个方面：首先，摄像机及实验材料限制了测量的时间分辨率和空间分辨率；其次，该实验只能操纵一条Lambda DNA链，实验效率较低；第三，实验中通过对磁球施加扭矩的方法使Lambda DNA发生扭转，施加到DNA上的扭矩远小于施加到磁球的扭矩，若要研究DNA的扭曲，其势必会对实验结果造成影响。
针对以上这些限制，有如下改进措施。
第一，磁球具有固有热涨落，仅考虑热涨落的影响，可检测到的磁球最小变化距离有如下形式[12]
(3)
式中，Sz(f)为磁球高度的功率谱密度(反映每单位频率波携带的功率的物理量)；Beq为等效噪声带宽；
图6 DNA链受力与分辨率的关系曲线[12]
(lc为DNA轮廓长度；Beq为等效噪声带宽)
图中分辨率由可分辨的最小尺寸表示，原式中常数κtether是基于双链DNA蠕虫链力响应模型计算得到的。从图中可以看出，分辨率随着受力的增大和DNA长度的减小而增大。当Beq=100Hz，DNA链长为1μm，受力大于3pN时，能够获得亚纳米级的分辨率。
摄像机可检测到的磁球最小变化距离有如下表达形式[12]
(4)
式中，Npixel为像素点的个数；fr为摄像机的采样率。因此，我们可以通过增加像素点的个数和摄像机的采样率来提高分辨率。目前摄像机和计算机的相关发展已经能够有效减轻由摄像机的位置追踪引起的局限性，有效提高实验分辨率。
第二，磁镊与其他的分子操纵技术不同，磁球受力方向的特殊性使其适合于平行测量。目前，基于磁镊的千分子操纵技术得以开发并用于研究酶对DNA的裂解活性[13]等方面的研究，有效提高了实验效率。
第三，由于磁镊的不对称磁场产生的大扭矩，用磁镊直接测量DNA分子的扭矩十分困难。针对这种情况，主流的设想是将该扭矩降低到DNA分子链内部储存的扭矩的水平，相关的工作还在开展中。例如，Gore等人利用非磁性小球对扭转进行灵敏测量,对DNA分子在拉伸状态下的扭曲程度进行研究，并发现DNA分子受力超过30pN时其扭转-拉伸耦合取负值。[14]
此外，还可以通过将磁镊与光镊，结合实现对磁球的三维操纵；通过将磁镊与荧光显微技术结合，实现对蛋白质与DNA结合位置的观测。
5 实验教学设计
目前，部分高校在本科阶段开设有物理生物学相关课程，但缺少相关的实验教学。而本实验基于目前物理生物学领域应用广泛的单分子操纵技术，其操作难度较低，成功率较高，无特殊的环境条件要求。因此适合在本科阶段开设相关实验，作为物理生物学课程的实验补充。
在该实验中，样品池的修饰阶段涉及浓硫酸等危险化学品的使用，因此学生应有老师陪同完成该阶段的步骤。如果有条件能让学生体验完整的生物物理实验，可安排连续的两天(第一天8～9h，第二天2～3h)或三天(第一天4～5h，后两天2～3h)时间；如果缺少条件，实验员可提前完成样品池的修饰，这样学生可以完成剩余步骤，所需时间约为2～3h。
6 结语
本文基于“单分子磁镊测量Lambda DNA的拉伸曲线”实验介绍了物理模型在生物学问题中的应用。根据本科物理实验教学的现状，详细介绍了如何为本科生开展操作难度适中的物理生物学实验。希望通过本文可以为其他高校提供参考经验，丰富教学课程设计。
附录1 实验仪器、材料
分析纯丙酮，分析纯甲醇，体积浓度30%过氧化氢溶液，98%浓硫酸，色谱级APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，分析纯戊二醛，地高辛抗体(Anti-dig)，钝化液(含PB，叠氮化钠，Pluronic)，PBS缓冲液，凡士林，去离子水，浓度为100pmol/ L的Lambda DNA，磁球(μm级)原液；
染色缸，烧杯，毛细管，三支大型滴管，标签纸，样品架，垫圈，两种不同规格的移液枪，移液枪枪头，医用针头及针管，锥形瓶，量筒，铁钳，医用胶带，乳胶手套，离心管，离心管架；
超声清洗仪，涡旋振荡器，显微镜及工业相机，水浴锅，CCD，搭载Image J软件的计算机。
附录2 毛细管修饰具体步骤
将毛细管置入染色缸，使用分析纯丙酮注入浸泡清洗30分钟，再取出毛细管，重新置于干净的染色缸，用甲醇超声清洗仪超声清洗毛细管30分钟；
将体积浓度30%过氧化氢溶液与浓硫酸3∶7混合，倒入新的染色缸，再将处理过的毛细管放入，放入水浴锅水浴，达到95摄氏度后水浴浸泡2h；
取出后用去离子水洗干净，彻底洗净并烘干后用APTS与甲醇(1∶50)混合液浸泡处理毛细管2小时(此步骤不可有水)；洗净后用戊二醛与水(1∶50)混合液过夜修饰，修饰完成后洗净。(均使用去离子水清洗)
此步骤全过程需在通风橱内完成。
附录3 磁球-磁球-DNA-抗体-管壁连接具体步骤
将20μL地高辛抗体用PBS缓冲液稀释至200μL，灌入样品池，在室温孵育40min，向样品池中灌入100μL钝化液，室温孵育20min；
使用涡旋振荡器充分振荡均匀磁球原液，取6μL置入200μL离心管，利用磁铁沉淀磁球并吸取上清液丢弃，再加入100μL PBS洗涤，反复三次，最终加入2μL PBS重悬；接着加入3μL浓度为100pmol/L的Lambda DNA，并轻弹管底使其混合均匀，然后在室温条件下使其充分连接20min，期间不时摇晃离心管，防止磁球沉淀；混合完成后加入100μL PBS稀释，然后将混合液轻轻灌入毛细管，向左立起样品架并等待约30min，以便DNA连接至毛细管左边侧壁；最后缓缓通过软管灌入100μL PBS，并以500μL/min的速度冲洗掉游离磁球和DNA。
参考文献
[1] 菲利普斯, 康德夫, 塞里奥特 著. 涂展春,王伯林,等 译. 细胞的物理生物学[M]. 北京：科学出版社, 2012.
[2] SELVIN P R, HA T J. Single-molecule techniques: A laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008.
[3] BOCKELMANN U. Single-molecule manipulation of nucleic acids[J]. Curr.Opin.Struct.Biol., 2004, 14: 368-373.
[4] STRICK T R, DESSINGES M N, CHARVIN G, et al. Stretching Macromolecules and Pro-teins[J]. Rep.Prog.Phys., 2003, 66: 1-45.
[5] PERKINS T T. Optical traps for single molecule biophysics: A primer[J]. Laser & Photonics Reviews, 2009, 3: 203-220.
[6] GREENLEAF W J, WOODSIDE M T, BLOCK S M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion[J]. Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct., 2007, 36:171-190.
[7] BINNIG G, QUATE C F, GERBER C. Atomic force microscope[J]. Phys.Rev.Lett. 1986, 56: 930-933.
[8] 王一舟. DNA及染色质高级结构的单分子研究[D]. 北京：中国科学院大学(中国科学院物理研究所), 2018.
[9] 陆越. 单分子磁镊研究大肠杆菌单链结合蛋白的结合性质[D]. 北京：中国科学院大学(中国科学院物理研究所), 2018.
[10] WATSON J, CRICK F. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxy-ribose nucleic acid[J]. Nature, 1953, 171: 4356.
[11] BRUCE A, JOHNSON A, LEWIS J, et al. Molecular biology of the cell[C]. New York, London: Garland Science, 2002.
[12] VLAMINCK I D, DEKKER C. recent advances in magnetic tweezers[J]. Annual Review of Biophysics, 2012, 41(1): 453-472.
[13] RAMANATHAN S P, Van Aelst K, SEARS A, et al. Type Ⅲ restriction enzymes communicate in 1D without looping between their target sites[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(6): 1748-1753.
[14] GORE J, BRYANT Z, NOLLMANN M, et al. DNA overwinds when Stretched[J]. Nature, 2006, 442: 836-39.
引文格式: 林舒轩，王硕，石赟琥，等. 单分子磁镊测量Lambda DNA的拉伸曲线[J]. 物理与工程，2019，29(5)：105-110.
END
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