肺孢子菌肺炎的诊断与治疗进展
肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jiroveci）综述
非HIV感染血液病患者的耶氏肺孢子菌肺炎（PCP）的ECIL治疗指南
肺孢子菌肺炎诊断方法的研究进展
肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）是由肺孢子菌在肺部引起的一种机会性感染，70%~90%的人免疫缺陷病毒（HIV）感染者一生可经历一次或多次PCP。近年来， 非HIV感染的免疫抑制患者中PCP的发病率升高，因此，寻找敏感的PCP早期诊断方法并对其进行优化尤为重要。现将PCP诊断领域的研究进展综述如下。
一、微生物学检测手段
PCP的诊断金标准为合格下呼吸道标本中检出肺孢子菌。下呼吸道标本包括诱导痰、BALF、经支气管镜获得的肺组织等标本。PCP患者的痰量少，痰涂片检出率相对较低。肺组织活检可获得足够的标本，检出率高，但同时大出血及气胸的风险增高。而BALF涂片镜检的阳性率较高且安全性良好，宜作为首选方法。
肺孢子菌的实验室染色方法分传统染色和免疫荧光染色。传统染色主要包括六甲基四胺银（GMS）、甲苯胺蓝（TPO）、吉姆萨（Giemsa）、迪夫快速（Diff-Quik）及瑞氏（Wrights）染色等。GMS染色对包囊染色的特异性好，对比度强，菌体易于辨认，简便快捷，现广泛用于肺组织印片的染色，但其无法识别滋养体和囊内小体，形态不典型时易误检。TBO染色的操作简便，但无法清晰显示肺孢子菌的内部结构，现已少用。Giemsa染色和Diff-Quik染色结果不稳定，与实验人员的技术密切相关。Calcofluor-White（CFW）染色法欧美国家常用，与GMS染色相比具有简便、快速、成本低等优点。近年来建立的直接或间接免疫荧光染色是较敏感的检测方法，操作简便可行，易于辨认包囊，痰阳性率可达52%，高于GMS染色，但敏感度低于PCR法。Choe等的结论类似，认为痰免疫荧光染色可用于HIV合并PCP的初步诊断。
二、血清学检测手段
1. 1，3-β-D-葡聚糖（G试验）：是肺孢子菌包囊细胞壁的主要组成部分，血清G试验是诊断PCP的有效方法之一，其特点是阴性预测值较高。在非HIV感染的免疫抑制合并PCP患者中，G试验的阳性率为90%~100%，敏感度和特异度为94.8%和86.3%。有学者认为在HIV病例血清G试验阴性可排除PCP，但对于非HIV患者，其结果应与临床症状和影像学结合综合判断。Damiani等认为下呼吸道标本PCR结合G试验可区别PCP和肺孢子菌定植。
2. 表面糖蛋白：是肺孢子菌细胞壁的重要成分。Daly等合成了3段覆盖Msg基因全长的重组表达片段用于检测患者体内PCMsg抗体，认为Msg用于肺孢子菌检测具有重要意义。Djawe等通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了110例PCP合并HIV患者（病例组）和63例其他肺炎合并HIV患者（对照组）的血清抗体对肺孢子菌主要表面糖蛋白重组片段C1（MsgC1）的反应，结果显示病例组的IgM和IgG水平明显高于对照组。健康人也可能携带肺孢子菌导致抗体检测阳性，因此确定易感人群抗体的基线水平，观察其动态变化更有意义。
3. 血乳酸脱氢酶（LDH）：LDH升高有助于PCP的诊断，尤其对HIV患者。LDH在病情进展较快时显著升高，有效治疗后下降，可动态反映PCP患者肺部炎症反应及病变的严重程度，与患者氧合指数的下降呈正相关。但LDH无特异性，作为预测参数的作用有限。
三、核酸定量检测手段——PCR法
应用PCR技术检测呼吸道标本的肺孢子菌特异性核酸片段取材方便，检测简便，对临床诊断有重要意义。
1. 普通PCR：其敏感度为99%，特异度为91%，可检测肺孢子菌DNA，但无法区分感染或定植，主要用于排除PCP。Fan等进行的荟萃分析结果表明PCR检测BALF用于诊断PCP的敏感度和特异度为91.3%~99.7%和82.7%~95.5%。由于敏感度高及定植的存在，普通PCR容易出现假阳性。
2. 巢式PCR：检测肺孢子菌基因量的最小值可达366 fg，其敏感度较高，尤其当吉姆萨染色镜检阴性时，巢式PCR仍有约65.5%的阳性率。其缺点是易污染，极微量的污染可造成假阳性。
3. 定量PCR（quantitative PCR，qPCR）：其原理是荧光信号随DNA载量的增加而增加，克服了普通PCR和巢式PCR存在的不能定量和假阳性等缺点，在区别肺孢子菌定植和感染时更有优势，敏感度和特异度更高。但不同患者群体qPCR的定量阈值不同，故不能作为指导诊断或治疗的依据。有学者指出，只要没有明确区分非HIV患者定植或感染PCP的阈值（只能通过qPCR实现），就不能建议用qPCR取代镜检。
4. 环介导恒温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）：是一种特殊的核酸扩增方法。在扩增过程中产生一种副产物——焦磷酸镁沉淀，通过肉眼可直接确定阳性结果。LAMP法较普通PCR的敏感度更高，且不与念珠菌、曲霉等其他真菌存在交叉反应。LAMP最低检测极限是10个拷贝，比PCR高10~100倍，可用于PCP的早期诊断，尤其是对非HIV患者。与巢氏PCR和qPCR相比，LAMP的敏感度和特异度稍低或相当，检出率无明显差异，但LAMP技术操作更简便，不需要昂贵的仪器，适合基层医院应用。
值得注意的是，痰标本中肺孢子菌往往成团聚集，不易检出。对于痰液和BALF涂片染色阴性的病例，可联合血清G试验，而PCR是唯一可靠的诊断措施。G试验结合qPCR能区分PCP与肺孢子菌定植。PCP发病时肺孢子菌处于快速有性繁殖扩增阶段，肺孢子菌定植时处于静止或低速无性繁殖阶段，这也是G试验结合定量PCR能区分PCP与肺孢子菌定植的理论基础。
四、影像学检查
影像学检查对PCP的临床诊断极为重要，胸部高分辨率CT是首选的影像学检查方法。磨玻璃征是最常见、最早期的影像学征象，以肺门周围及双肺中、下部为主，继而出现间质改变。磨玻璃征可分为弥漫型及斑片状融合型，弥漫型多见于HIV感染者，类似肺水肿改变；斑片状融合型多见于非HIV感染者。铺路石征也是PCP常见的早期征象，是肺间质内细胞增殖导致小叶间隔增厚而形成，该征象表明肺泡和肺间质同时受累，是疾病进展的重要表现。细网格状改变也很常见，主要是间质病变加重或纤维组织增生所致，提示急性炎症吸收不良。肺气囊是PCP较有特征的表现，好发于胸膜近处肺实质内部，是由炎症或纤维化导致肺组织反复重构形成，通常较小且多发。月弓征是指病变早期或进展期在胸膜下正常肺组织形成的新月形或弓形区，代表尚未受累的肺外周组织。81%的HIV感染相关PCP患者的病变呈明显的弥漫性分布，而肾移植者仅为31%。吴菊意等分析HIV感染合并PCP患者早中期与晚期的CT征象发现，早中期以月弓征为特异性，而晚期则以气囊或空腔性变、纤维条索状影为典型表现。
目前，PCP尚无较好的早期诊断方法。病原学染色法敏感度低；血清抗体检测因健康人群普遍携带肺孢子菌抗体而临床诊断价值不明确；G试验为非特异性，但可作为评估PCP病情严重程度的指标；涎液化糖链抗原和LDH在PCP发病时显著升高，但只提示肺损伤的严重程度，不能作为预后的预测因素；PCR方法的敏感度最高，应考虑优先使用。符合PCP临床表现和影像学表现的患者，血清G试验升高和呼吸道标本中肺孢子菌 DNA拷贝数增加是诊断PCP的较好指标。若肺孢子菌能在体外培养成功，将对PCP的诊断产生重要影响。未来，将血清学指标与影像、PCR等联合应用，并积极寻求早期、特异、无创的新型检测方法将是PCP诊断的研究重点。
引用: 王瑜琼, 黄琳娜, 詹庆元. 肺孢子菌肺炎诊断方法的研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志,2020,43 (10): 878-880.
肺孢子菌肺炎的治疗进展
肺孢子菌肺炎(PCP)是诱发免疫功能低下患者呼吸衰竭的主要原因，也是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者最常见的机会性感染之一，在高效抗逆转录病毒和对PCP预防性治疗广泛应用以后，PCP的发病率大幅下降；近期有研究报道在西欧和美国的AIDS患者中PCP的发生率小于1例/100人年。但是大多数病例发生在未知获得性免疫缺陷病毒(HIV)感染或还没有接受HIV治疗的患者，或者免疫功能严重低下感染者(CD4细胞计数小于100个/μl)。PCP仍是导致与AIDS有关的死亡的最常见原因，而且在AIDS合并PCP疾病早期阶段即需要机械通气的患者，其并死率显著增加[7]。因此PCP的治疗对于AIDS患者的预后至关重要。
1 复方磺胺甲恶唑
复方磺胺甲恶唑是磺胺甲恶唑和甲氧苄啶制成的复合片(SMZ-TMP)，目前仍然是临床预防和治疗PCP的一线药物，早期研究认为SMZ-TMP治疗PCP的效果明显优于喷他脒。治疗PCP时磺胺甲恶唑(SMZ)推荐剂量为75～100 mg/kg，甲氧苄啶(TMP)的推荐剂量为15～20 mg/kg，目前我国临床常用的为复方新诺明，每片含活性成分为SMZ 400 mg和TMP 80 mg。该药物的作用机制主要是抑制叶酸合成，而叶酸是肺孢子菌生存必需的成分。SMZ可以结合二氢叶酸合成酶(dihydropteroate synthase，DHPS)基因位点从而抑制DHPS的生成，TMP可以结合二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因位点从而抑制DHFR的生成，这两种酶都是叶酸合成过程中的必需酶。随着SMZ-TMP预防和治疗使用量增加，PCP对此类药物产生耐药突变的报道也越来越多，有研究者报道南非预防性使用SMZ-TMP的HIV感染者中，分离的PCP菌株中56%产生了DHPS基因突变，且有学者报道DHPS基因突变与PCP对SMZ的耐药有关。但是有研究认为DPHS基因突变会增加磺胺类药物预防失败的风险，但是并没有增加接受治疗人群的病死率。而DHFR基因突变可以导致PCP对TMP耐药，也可能与PCP治疗失败相关。但近期一项德国的队列研究显示在PCP患者中虽然存在DHPS和DHFR突变，但非常罕见的是，没有观察到治疗失败与DHFR或DHPS基因型的联系；因此基因多态性对治疗失败的贡献尚需要进一步研究。
由于SMZ-TMP经常引起皮疹、药物热、肝肾功能异常、中性粒细胞减少等不良反应，我国一项多中心研究发现HIV感染者使用SMZ-TMP治疗PCP时，SMZ-TMP的肝毒性发生率16.4%。与健康人(3%～5%)相比，HIV患者对SMZ-TMP药物超敏反应的发生率更高(40%～80%)，男性、梅毒史、CD4/CD8比值<0.10、CD4细胞数低均可增加SMZ-TMP过敏的风险。但是我国学者调查发现预防性使用SMZ-TMP患者中超敏反应的发生率高达47.7%，而且当CD4＋ T淋巴细胞>37.4/μl、自然杀伤细胞>108.78/μl时，使用SMZ-TMP治疗PCP的患者发生超敏反应的风险会增加，因此对于SMZ-TMP引起过敏的高危因素及机制有待进一步研究确认。
对于使用SMZ-TMP过敏而又不能更换其他药物治疗的患者，可以在做好抢救措施的前提下使用脱敏疗法，有报道脱敏后使用SMZ-TMP治疗PCP也是安全有效的。为了减少该药物的不良反应发生率，有学者开始探讨更低剂量的SMZ-TMP方案，Creemers-Schild等采用TMP 10～15 mg·kg-1·d-1的方案，并且其中一组患者(23%)在经过中位时间4.5 d后TMP降为4～6 mg·kg-1·d-1，2组患者的预后和常规治疗方案差异无统计学意义，这就提示我们可以进一步探讨合理减少SMZ-TMP用量，从而降低药物不良的发生率。
2 补救治疗
对于SMZ-TMP方案不耐受或者治疗失败的PCP患者，《中国艾滋病诊疗指南(2018版)》推荐采用补救治疗方案，替代治疗方案包括克林霉素600～900 mg，静脉滴注，每8小时1次，或450 mg口服，每6小时1次；联合应用伯氨喹15～30 mg，口服，1次/d，疗程21 d。氨苯砜100 mg，口服，1次/d；联合应用TMP 200～400 mg，口服，2～3次/d，疗程21 d。或喷他脒3～4 mg/kg，1次/d，缓慢静脉滴注(60 min以上)，疗程21 d。2001年发表的一份meta分析中，27项研究中共计497例经微生物学证实需要挽救治疗的PCP患者，克林霉素和伯氨喹的联合治疗方案(clindamycin/primaquine，C-P方案)是所有替代方案中治疗成功率最高的，与静脉注射喷他米相比，C-P方案轻度到中度患者的治疗成功率更高。2009年发表的一项队列研究纳入了1 122例患者，以3个月生存率为评价指标，发现喷他脒治疗HIV相关的PCP会增加病死率，而C-P方案与SMZ-TMP方案治疗的3个月生存率相当。
我国学者对非HIV感染的PCP患者中一线治疗方案(SMZ-TMP)不耐受或者治疗失败的采用C-P方案治疗方案，发现一线治疗失败的13例患者中有4例患者治愈，而不能耐受TMP-SMZ的6例患者均治愈，可见一线不耐受患者C-P方案效果较好，而一线治疗失败的患者换用C-P方案效果同样欠佳，但是部分患者仍可能有效。有研究分析对肾移植后并发PCP治疗，结果一线治疗失败的2例患者换用C-P方案后同样治疗失败，而C-P方案治疗失败的患者换用SMZ-TMP方案后治疗有效，但是SMZ-TMP方案的药物不良反应发生率高于C-P方案。
3 激素治疗
各种指南均推荐对中-重度PCP患者建议联合应用糖皮质激素治疗。在AIDS流行的早期，众多随机对照试验研究评估了辅助激素治疗对于中度至重度AIDS合并PCP患者预后的影响，结果表明早期激素治疗不仅可以显著提高患者生存率，同时减少并发症如气胸、呼吸衰竭。Gagnon等和Montaner等发表的随机双盲对照试验结果确认在HIV合并中重度PCP患者在发病72 h内可以增加存活率，激素治疗组存活率为75%，而对照组存活率仅有18%，作者建议AIDS合并重症PCP患者在发病72 h内给予甲泼尼龙每次40 mg，每6小时1次，持续至少7 d，然后逐渐减量。
而另一项对照研究纳入251例AIDS合并中到重度PCP患者，治疗组给予泼尼松龙40 mg/次，每12小时1次，治疗5 d后改为1次/d再继续治疗，然后改为泼尼松龙20 mg/次，1次/d，治疗11 d，研究结果显示在第31天、第84天的呼吸衰竭发生率和病死率都低于对照组。该激素治疗的剂量和疗程方案也成为后来中重度PCP的标准治疗方案。后来相继有其他研究进一步证实了激素治疗是安全有效的，已有荟萃分析结果显示早期应用糖皮质激素可以降低AIDS合并PCP患者的病死率，最近的一份系统评价仍然证实激素对于改善重症PCP是有意义的，指南推荐对于中重度感染患者，应在72 h内应用启动病因治疗和激素治疗，我国AIDS诊疗指南推荐：对于中-重度PCP患者[呼吸空气时肺泡动脉氧分压差P(A-a)O2≥35 mmHg或PaO2<70 mmHg]，早期(72 h内)可应用激素治疗，泼尼松40 mg，2次/d，口服5 d，然后减量至20 mg，2次/d，口服5 d，20 mg，1次/d，口服至疗程结束；静脉用甲基泼尼松龙剂量为上述泼尼松的75%。
但激素同样会引起一些不良反应，因此如何更加合理使用激素剂量和疗程也逐渐成为研究关注点，日本一项的回顾性分析发现HIV-1合并中重度PCP患者并非一定需要21 d的激素疗程，其研究发现30%患者激素只需要使用10 d，60%的患者只需要14 d就可以取得同样效果，对于中度PCP患者只有9%的患者需要激素疗程大于14 d，而重度PCP患者却有35%患者激素治疗需要超过21 d，而且结果显示重度PCP患者病死率为13%，而中度PCP患者无死亡病例。激素疗程能够小于14 d的患者与其CD4计数水平较高相关，其研究认为HIV相关PCP患者中，60%的中重度患者和90%的中度患者激素疗程没必要超过14 d。
激素治疗时间需要根据患者临床实际情况权衡利弊，已经有众多研究对于激素治疗的风险及安全性进行阐述有学者针对呼吸窘迫综合征患者的激素治疗时长进行探索，发现对于未恢复的ARDS患者，适当延长激素治疗时间可以改善肺损伤、降低多器官功能障碍综合征评分以及减少病死率，且不会增加机会性感染风险，因此激素治疗时长应当个体化，适当延长激素治疗时间未尝不可。
4 非HIV感染者PCP的激素治疗
HIV感染者和非HIV感染者并发PCP后，抗真菌治疗的差异并不明显，但是激素治疗效果在非HIV感染者的中重度PCP是否有效存在争议，有研究认为激素可以改善预后，也有研究认为治疗无效。韩国的一项回顾研究认为不管患者以往是否曾经使用激素，在并发中重度PCP后使用激素治疗的预后没有明显区别。一项meta分析研究发现，以死亡和接受气管插管呼吸机辅助通气为主要终点和次要终点分析，激素治疗不能改善非HIV感染者合并PCP人群的预后。有研究针对非HIV感染的伴有低氧血症的PCP患者进行分组治疗比较发现，大剂量泼尼松(≥1 mg·kg-1·d-1)的患者病死率为51.8%，而低剂量泼尼松<1 mg·kg-1·d-1组的患者病死率为25%，而未使用泼尼松的患者病死率为23%，统计分析结果认为非HIV感染者的重症PCP使用大剂量激素会增加病死率。尽管如此，对于非HIV感染者合并重症PCP的患者，临床医师仍然会尝试用激素来改善呼吸衰竭症状，北京协和医院和中日医院分析非HIV感染者PCP合并急性呼吸衰竭的患者中，96.7%的患者联合使用了糖皮质激素治疗，患者的住院病死率为76.1%，其中79.33%的患者每日激素用量≥80 mg。而在结缔组织病患者PCP合并急性呼吸衰竭病例中，所有患者均使用了SMZ-TMP联合激素治疗，患者的病死率仍然高75.6%，结果提示激素联合TMP-SMZ方案对非HIV合并PCP的患者效果欠佳，尚存在需要改进的地方。
目前SMZ-TMP治疗PCP已经成为一线治疗方案，对于SMZ-TMP过敏的患者，可以脱敏后治疗，但是对于严重过敏或者因为不良反应难以耐受该方案者，C-P方案可以做为挽救治疗，卡泊芬净的治疗效果可以做为联合治疗方案之一做为备选。HIV合并中重度PCP患者早期使用激素能改善预后，对于轻中度的患者可以适当缩短激素疗程以减少激素不良反应，对于初始治疗时机较晚的患者，如果需要呼吸机辅助通气时往往预后较差，而加大激素剂量和延长疗程是否能够改善预后还值得探讨。而对于非HIV感染者的中重度PCP患者，激素治疗可能无法改善预后，如何能够通过抗感染治疗改善预后需要更多研究和探索。
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