生物工艺中，更好的纯化和回收策略
在任何生物工艺的下游部分，人们都必须先挑出“渣滓”，然后才能获得“黄金”- 生物工艺想要产生的生物治疗药物。不幸的是，渣滓不仅数量多，而且样式也多。而生物治疗用的“黄金”，不像真正的黄金，是可以“腐蚀”的。也就是说，它可能遭受结构性破坏和活性损失。
当丢弃渣滓、收集黄金时，生物工艺过程必须是高效且温和的。它们必须尽可能地消除污染物和有机碎片，同时确保生物产物避免聚集诱导性应激，并在纯化和回收过程中保持其完整性。否则会降低其纯度和产量。
为了有效且温和地纯化和回收生物产物，生物工艺必须利用最适当的工具和技术。在这里，我们将与几位专家讨论哪些工具和技术可以帮助生物工艺克服持续的挑战。其中一些专家还谈到了可以帮助生物工艺应对新挑战的新方法。
优化亲和纯化
Avitide技术开发副总裁Karol Lacki博士说，大多数高效的纯化工艺始于亲和层析捕获步骤，“去除大部分杂质并提供所需的浓缩因子”。后续的纯化步骤用于去除残留的工艺和产物相关杂质。
Lacki和他的同事开发了定制化亲和填料，用于纯化难以纯化的生物治疗产物。Avitide的“亲和填料的特点是对目标物的高特异性、高结合载量以及高碱稳定性 - 高达0.5mol氢氧化钠，”Lacki解释道。该填料是根据客户要求的规格开发的，Avitide可在12周内定制填料。
“这将是一种用于工艺开发、测试，甚至毒理学研究的填料，”Lacki断言。再多5个月，就可以开发用于cGMP的填料。除了开发定制填料，Avitide还在扩大其亲和填料的“目录”，如用于纯化腺相关病毒(AAV)基因疗法和SARS-CoV-2刺突蛋白疫苗。Lacki解释说:“由于这些填料也具有碱稳定性，因此可以重复使用层析柱多次，大大降低了纯化成本。”
Lacki说，无论生物工艺如何发展，在可预见的未来，分离技术都不会发生任何重大变化。他坚称:“基于亲和的纯化将会持续下去。纯化或分离发生在表面，而表面化学仍将是层析的核心和灵魂。”他补充说，但科学家仍将继续面临纯化方面的挑战。
解决抗体聚合
在基于抗体的治疗产品中发生的聚集会降低产品的保质期。更糟糕的是，它可能危及患者。含有聚集抗体的治疗产品可能引发不必要的免疫反应。如果聚体足够大，它们甚至会阻塞血管。
在大多数抗体的生物工艺过程中，至少在某些条件下，都会发生聚集。因此，常见的生物工艺挑战包括保持蛋白质的稳定性以及防止蛋白质聚集也就不足为奇了。
Avantor生物制药生产解决方案研发副总裁Nandu Deorkar博士说:“在生物工艺中，如果抗体暴露在应激条件下，如过高的pH值和温度水平，以及与使用劣质原材料相关的影响，痕量元素的存在，剪切力，微或纳米颗粒杂质的存在，抗体聚集就有可能形成。”在生物工艺过程中，天然蛋白单体也会附着在现有的蛋白质低聚体、污染物或容器表面而聚集。
由于聚集是如此普遍，且会造成很多问题，生物工艺行业采取了各种方法来减少或消除它。Deorkar详细介绍道：“工艺物料和辅料，如缓冲液、盐、表面活性剂、氨基酸和糖，可以帮助防止聚体的形成，并在产品的整个保质期确保足够的稳定性。关键是选择具有合适质量的原材料，以及始终一致地控制游离脂肪酸、痕量元素、反应性和纳米颗粒杂质的辅料。”
生物工艺行业还可以利用新技术减少聚集。例如，Deorkar解释说，“某些基于新的Protein A亲和配基的填料可以通过在上样或洗脱缓冲液中使用添加剂来去除聚体并使聚体最小化。” 他补充说，Avantor最近已经证明，其Protein A填料，J.T.Baker Bakerbond PROchievA可以“通过优化条件和分馏洗脱，去除90%以上的高分子量杂质。”
在未来，抗体聚集可能会是一个更大的挑战。Deorkar指出:“皮下注射产品的开发是生物治疗的一个趋势。这些产品提供了给药的方便性，并可减少医院就诊次数，但通常需要高浓度的制剂。”然而，生产高浓度的制剂需要克服三个关键的挑战：溶解性差、高粘度以及聚体的增加。为此，Avantor开发了能够解决这些挑战的辅料。“这些辅料，”Deorkar断言，“适用于广泛的浓度范围。”
抗体 – 药物偶联物
与抗体一样，抗体-药物偶联物(ADC)在生物工艺过程中也需要“特殊处理”。ADC是一种靶向药物，顾名思义，其由与一种药物甚至多种药物结合的抗体组成。ADC中的抗体与特定的抗原结合，因此它可以引导偶联药物到达体内表达这些抗原的细胞上。
如今的ADC越来越复杂。例如，Mersana Therapeutics有一个叫做Dolaflexin的ADC平台，它可以在每个抗体上添加比通常数量更多的药物。Mersana的首席生产官Michael Kaufman博士说：“(它可以) 将10个‘弹头’安装在一个抗体上，而行业标准是2、3或4个。”
Mersana Therapeutics使用一系列抗体-药物偶联物 (ADC) 平台来设计和测试ADC，用于治疗癌症。每个ADC批次，如图中所示，都是平衡ADC质量 (如有效载荷、药物抗体比、偶联位点和均质性) 工作的顶点。公司还依赖于一系列的纯化技术 – 层析、超滤/洗滤和离心。
尽管创造10弹头ADC有潜在的临床益处，但也导致整个过程更加复杂。Kaufman指出：“Dolaflexin平台非常复杂，需要制备非常复杂的物料混合物。这本身并不是坏事 - 许多已经明确的药物都是多种物质的混合物。(肝素就是一种非常复杂的物质。) 但是复杂的混合物会给你的工艺带来额外的压力。例如，复杂的混合物可能会让你很难一批又一批可再现性地进行纯化。”
为了处理复杂的混合物，Mersana使用了一种结合强阳离子交换层析的纯化方法。尽管这是一种已建立的层析形式，但使用它来纯化由Dolaflexin平台生成的产品需要Kaufman所说的“非常复杂的优化”。
他解释说:“我们需要确保我们得到了我们真正想要开发作为治疗药物的分子部分。我们排除了分子中其它没有任何作用的部分。”
复杂的纯化方法会降低生物工艺的产率，而与Dolaflexin平台一起使用的纯化方法肯定是复杂的。因此，毫无疑问，该平台在收率方面面临着不小的挑战。最初，平台加上强阳离子交换层析的收率仅为40%。然而，Mersana的科学家设法将收率提高到了65%。
此外，科学家通过优化填料可以捕获的药物量而缩短了纯化时间。Kaufman说：“时间从大约两天缩短到了大约半天。所以，我们姑且称其生产力提高了4倍。”
提高药物回收的数量并不完全在于更好的层析法。“总的来说，如果你可以回收你的产品，并通过过滤进行分离和回收，而不是层析，这对任何工艺都将是一个巨大的效率提升，因为过滤比层析分离更快、更简单，”Kaufman解释说。“在Dolaflexin平台上，我们用切向流过滤取代了三个层析步骤，且运行非常迅速和有效。”
基因疗法
除了抗体相关的治疗性产品，生物工艺也制造基因治疗，这些“产品越来越受欢迎，范围越来越广，”BaleyReeves博士说，他是国家治疗制造中心(NCTM)的一名研究科学家。“目前有超过80种产品正在进行III期临床试验，约占生物药管线的12%，而且这些数字还在继续攀升。”
美国国家治疗制造中心(NCTM)是德州农工大学工程实验站的成员，其是一个跨学科的人员教育和研究中心，服务于全球生物制药和疫苗行业。在NCTM，学生们接触到各种各样的纯化挑战，包括那些发生在基因疗法的生产过程中的挑战。
在NCTM，Reeves和她的同事正在研究杆状病毒表达的AAV-2载体，以用于基因治疗。正如Reeves所观察到的，“多种表达宿主和不同的载体血清型可以使用。”应该指出的是，所有基因治疗产品都是由病毒衣壳或蛋白质壳内的目的基因组成的。
“不幸的是，在上游的工艺中，并不是所有的衣壳最终都携带有目的基因，”Reeves继续说。“因此，下游工艺的关键部分是将完整衣壳(所需产品)与空衣壳(产物相关杂质)分离开来。”
为了解决这一纯化挑战，供应商开发了用于AAV纯化的新型亲和填料。Reeves指出，其中一种填料是Thermo Fisher Scientific的POROS CaptureSelect AAVX亲和填料。她说:“这不是AAV衣壳可用的唯一亲和填料，但它已经被证明比我们尝试过的其它品牌的捕获层析步骤更好。要从完整的衣壳中分离出空衣壳，还需要额外的步骤 - 通常是离子交换层析或超速离心。”
大量的空衣壳也给回收带来了挑战。Reeves说:“在基因治疗领域，整个过程的回收率往往比传统生物药产品要低。我们通常看到工艺回收率低于25%，我们的合作者也报告了类似的结果。”
Reeves认为，基因治疗的最大障碍是回收率水平低。到目前为止，这个问题的解决方案仍然难以捉摸。“这可能需要多管齐下的方法，包括在上游使用更高的生产滴度，以及在下游开发更强大的平台工艺，”Reeves建议。“随着越来越多研究文章的发表以及最佳实践的确立，这些都将随时间而发展。随着我们更多地了解如何制造病毒载体，工艺收率无疑将上升。”
放眼未来
未来的生物工艺方法肯定会使纯化和回收更加有效。工艺也应该能运行得更快，甚至可能成本更低。然而，这些指标 - 效率、速度和成本 - 并不是行业所要考虑的全部内容。
回收生物治疗产物可能需要一组专家，特别是如果生物疗法是抗体-药物偶联物 (ADC)，比如Mersana Therapeutics生产的那些。ADC混合物通常是复杂的，包括不同的药物抗体比和不同的偶联位点。
即使在今天，生物工艺也面临着提高其可持续性的压力。一些公司已经认真对待这一问题。例如，在Mersana，Kaufman肯定提到了切向流过滤比仅用层析法纯化治疗产品更环保。他说:“这种过滤产生的废物要少得多，而且根本不会产生任何有机溶剂废物。从环境的角度来看，我感觉很好。这是为环境所做的正确的事情。”
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