细胞培养澄清收获的技术及经济考量：碟片式离心机和一次性离心机
本文节选自“Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
在过去的几十年中，生物制药生产的生物工艺在上游和下游工艺方面都取得了重大的技术进步。上游细胞培养工艺的强化导致了更高的细胞密度，使更小的生物反应器能够提供与更大、更低滴度系统相同或更高的产量。这些高强度培养增加了上游和下游工艺之间的工艺负担：特别是收获分离，增加的负担可能会改变给定收获技术的一些技术和经济效益以及缺点。考虑到这些变化，我们在这里回顾了主要收获技术的操作基础，并讨论了生物工艺工程师在为其强化工艺选择合适技术时可能考虑的潜在因素。本文将总结在上游强化背景下“老化”技术面临的具体挑战，以及实施新策略和新兴技术的前进道路。利用生物工艺经济学建模工具，我们研究了两种广为接受的技术的经济性：碟片式离心和一次性深层过滤，并讨论了生物工艺趋势将如何影响这些收获方法的经济性。考虑到生物工艺不断变化和多样化的格局，可能没有万能的解决方案，并且必须仔细权衡许多因素，才能选择合适的收获分离技术。
在过去的几十年中，生产生物制品（如mAb）的细胞培养技术在通过细胞生物学和工艺生物技术的进步提高生产滴度方面取得了巨大进步。在工业规模上，强化上游工艺的影响对下游的生物工艺操作产生了连锁反应。下游工艺(DSP) 通常与层析纯化和精纯以及最终制剂洗滤相关。已有多篇优秀的评论和文章讨论了DSP 的强化主题。然而，一个将细胞培养与层析分开的简短但关键的工艺步骤是：收获。
收获的目标是为层析准备收获的物料，主要是指去除固体，如细胞、细胞碎片和任何沉淀物，包括细胞裂解产生的碎片。这种物料会迅速堵塞昂贵的层析填料，例如Protein A。其次，希望收获工艺去除大量可溶的非产物物料，诸如核酸和宿主细胞蛋白之类的可溶性物料会导致层析柱上样时间减慢、杂质水平升高并最终缩短层析柱寿命。去除固体和可溶物的努力通常需要契合的收获技术，以获得最大收率。图 1中可以看到采用不同技术的典型收获链。
图 1. 收获技术的分离机制概述。碟片式离心机 (DSC) 使用离心力来浓缩可在离心机外围去除的颗粒。一次性离心机 (SUCF) 有两种主要形式 - 管式离心机和离心淘析（Elutriation）。管式离心机（顶部SUCF）在狭窄的腔室中去除颗粒并允许连续分离。离心淘析（底部SUCF）平衡离心力和流体动力，以将颗粒保留为流化床。深层过滤器(DF) 通过截留和吸附可溶性杂质将颗粒截留在多孔介质中。切向流深层过滤(TFDF) 将流体切向输送到深层过滤器式介质，以减少过滤器基质的结垢。诸如切向流过滤(TFF) 和交替使切向流过滤 (ATF) 等微滤方法将流体沿膜表面切向进料，以减少过滤器结垢并根据孔径进行选择性过滤。
过去十年上游工艺 (USP) 的进步不仅挑战 DSP层析，而且还挑战收获操作技术。细胞密度、细胞碎片杂质和其它固体的增加给收获和澄清工艺带来了新的挑战。实际上，收获技术需要适应这些不断提高的杂质水平，因此在选择适合给定工艺的技术时，了解基本的收获技术变得越来越重要。本文将回顾工业规模细胞培养收获（例如补料分批）中使用的典型方法和设备的基本设计、操作和特征，并重点介绍了一些有前景的新型收获技术。我们还将提供一个案例研究，比较了两种最流行的技术 - 离心和一次性深层过滤的经济性。总体而言，我们的目标是强调在选择收获工艺时要考虑的一些关键方面，特别是在上游过程工艺时。
典型收获技术
碟片式离心机
市面上有多种离心机设计，可以在其它文章中找到对离心机的全面介绍。工业规模使用的主要设计是碟片式离心机(DSC)，主要由不锈钢制成。如图 1 所示，DSC 设计有倾斜的锥形盘围绕垂直旋转轴同轴堆叠。物料通过进管进入，该进管沿旋转轴延伸并流向转子底部。在这里，它通过所谓的分配器被重新导向分离室的外边缘。分配器设计有导向翅片，可在流体进入加速流体。转子的旋转对细胞培养物料施加离心力，导致固体沿着转子的最外半径分离和堆积。澄清培养物料在锥形盘之间径向向内流动，沿途继续被澄清。最后，已去除固体的流出流体离开转子并继续进入下一个单元操作或储罐。
为了连续或半连续运行，必须除去颗粒状固体。这通常通过颗粒的周期性径向排放来完成，或者通过转子的蛤壳状开口或通过喷嘴。入口中较高的固体百分比将需要更频繁地排放离心机转筒，如果不仔细监控，可能会导致产品损失到颗粒状固体流中。另一方面，DSC的连续性可实现非常大体积的处理，而不会停止或堵塞。与半连续操作相比，连续操作降低的脱水能力会导致更高的产品损失和更多的固体逸出离心液。在这种情况下，时间和流出物纯度是关键的权衡。为了减轻这种权衡，Richardson和 Walker 进行了研究，通过开发一种自适应反馈过程来控制分离，以改进连续操作方法并降低离心液浊度。通过这种自适应反馈过程，有效降低了离心液浊度，提高了下游过滤的性能。
收获哺乳动物培养液时，DSC 的一个潜在问题是剪切对澄清的影响。特别是 DSC 离心会引入对哺乳动物细胞有害的高剪切环境，从而导致杂质进入下游纯化操作以及整体产品质量问题。这种剪切力在进料入口处最高，流动力会导致细胞破裂，释放宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、蛋白水解酶和其它可溶性细胞杂质。虽然较低的进料速率通常会导致更大的分离，但由于进料区的停留时间较长，它会增加细胞裂解。相反，必须在离心机转速和进料速度之间找到平衡。计算流体动力学（CFD）已被证明是开发最佳操作范围的关键要素，并且可能在 DSC 等复杂系统的工艺优化中发挥更大的作用。
DSC 擅长去除固体杂质，但通常难以去除可溶性杂质。出于这个原因，离心后通常进行二次处理，一般是深层过滤，以去除任何细胞碎片并减少HCP 和细胞 DNA。HCP 是一系列复杂的蛋白质，具有不同化学和物理特性，如果掺入终产品中，这些蛋白质会对患者产生免疫原性。这些杂质的增加会给层析纯化带来更高的负担，并且可能需要多个层析步骤才能将杂质水平降低到可接受的水平。随着杂质水平的增加，层析填料的寿命和效率也会降低。
DSC 的规模放大过程旨在根据进料速率、转速和离心机尺寸建模澄清效率。建模DSC 的主要方法是通过一个称为 Sigma 理论的概念。Sigma 理论基于进料速率 (Ǫ) 和所谓的等效沉降面积或Sigma 因子 (Σ)。Sigma 因子考虑了离心机的几何形状和转速。它被认为是等效的沉降面积，因为它代表了重力沉降器所需的横截面积，以通过离心机实现类似的澄清。在放大过程中，Ǫ/Σ的比率在两台离心机之间保持不变，以实现类似的澄清。仅通过 sigma 因子从小规模放大到大规模可能是不够的，并且会导致大规模离心本身产生的颗粒的性能出乎意料的低下。因此，需要额外的经验数据来解释放大时需要包含在建模过程中的未知因素。
尽管有 sigma 因子的潜在帮助，但由于缺乏实验室规模的模型，规模缩放对于 DSC 仍然是一个相当大的挑战。使用 GEA Westfalia 的 CSA-1 离心机以30 L 的中试规模完成了最小测试的 DSC。10 L 目前被视为使用此模型进行缩放的较低工作体积。然而，由于成本、设施要求和规模-代表性考量，许多中试实验室仅能缩小到 100 + L。
对于这些常见的高“最小”体积，行业已经尝试了多种方法来缩小到实验室规模。如果确定了准确的Sigma 因子，则经过充分表征的工艺仍然可以在不同的离心机类型中使用Sigma 理论。这需要多项实证研究来开发准确的模型。以前的方法涉及修改中试规模的DSC 模型以减少滞留体积。这是通过用填充空隙体积的实心插件替换碟片组中的碟片来完成的。较新的研究使用台式离心机来模拟工业规模的性能，只需要几毫升的物料。然而，仅用台式离心机无法模拟工业规模离心机中对细胞的剪切损伤，并且在离心之前需要额外的剪切诱导装置以正确匹配规模化的性能。这种所需测试体积的减少可以降低工艺开发成本并减轻对大体积测试物料的需求，而这些物料通常在工艺开发的早期受到限制。这些新的发展使得开发精确的规模缩小模型成为可能，但每种模型的方法和设备都是独一无二的。尽管进行了这项研究，但DSC 仍然缺乏可在实验室规模上使用的、广为接受的稳健规模缩放方法。
一次性离心机系统
用于细胞培养收获的一次性离心机 (SUCF) 系统是相对较新的技术。目前市场上有几种具有工业规模收获潜力的SUCF。由于生物制药行业对新技术的采用率低，关于将 SUCF 用于工业规模收获的研究有限。
SUCF 的一种方法是利用逆流离心淘析，例如Sartorius 的 kSep® 系统和 Thermo Fisher Scientific 的 Rotea™。如图 1所示，离心淘析系统由一个旋转室组成，其中流体逆着离心力流动。离心力和流体动力的平衡允许细胞截留在淘析室中。这形成了细胞的流化床，然后可以根据产品，收集或丢弃这些细胞。因为淘析室只有 2个端口，一旦在室中积累了足够的固体，就必须反转流动以排出固体，这会延长操作时间。为避免产品与流化的细胞一起损失，要么必须进行清洗步骤，要么必须将物料循环回细胞培养反应器。15%到 30% 的工艺时间被用于清洗和去除细胞。这种循环行为使得淘析在哺乳动物细胞培养工艺中的应用有些问题。
淘析的低剪切力可以维持细胞活性，以及在缓冲液中轻松漂洗和悬浮细胞的能力。由于这些特性，淘析装置通常用于纯化细胞，用于细胞治疗、灌流或其它相关应用，以回收细胞。这些应用将细胞作为主要产品，而不是可溶性蛋白质。因此，此类工艺对细胞裂解和杂质更加敏感，因为这直接影响工艺产量。从这方面考虑，淘析设备在细胞治疗领域的市场地位最为稳固。
尽管淘析对于收获可能有一些潜在的挑战，但已经有研究用于此类工艺。Ko和 Batia 研究了用于收获的淘析装置，结果表明该装置可以在 5 × 10^6 cells/mL 的相对低细胞密度下以大约350 L/h 的进料速率运行。这表明它可以在 8 小时轮班内收获高达 2,800 L 的体积。如果不增加离心力来平衡阻力以维持流化床，则增加流速会导致细胞与离心液一起离开。Lutz等人发现更高的细胞密度需要更慢的流速来保持分离效率，这表明现代工艺中典型的细胞密度（例如15- 30+ x 10^6 cells/mL）将需要比Ko 和 Batia所建议的更长的收获时间。这部分是由于细胞聚集通常随着细胞密度的增加而增加，从而增加了平均粒径。对于较大的颗粒，阻力更大，并且需要较慢的流速或更高的离心力才能保留在淘析室中作为流化床。更高的细胞密度也将更快地填充淘析室，需要更频繁的排放循环，并导致更低的有效流速。与半连续DSC 面临的挑战类似，排放循环可能会降低灵活性，并限制更高细胞密度下的分离效率。
Rotea 专为高达20 L 的细胞治疗应用而设计，而 kSep 系统有不同的型号，最高可处理数千升。kSep 系统有两种尺寸，用于不同的工艺规模，配备 4 × 100 mL 或 6 × 1000 mL 淘析室。kSep 系统具有内置的可放大性，因为它只能在一个腔体活动的情况下运行。根据型号，工艺可以放大四到六倍。小规模版本的滞留体积为400 mL，操作所需的物料不到 10 L。考虑到这些规模，Rotea 可能最适合个性化自体细胞疗法，规模放大的kSep 可能会在异体细胞治疗领域表现出色。
SUCF 的其它例子是来自CARR® Centritech 的Unifuge 和 U2k。Unifuge 和U2k 操作模式类似于更传统的碗或管-碗式离心机技术。在 U2k 模型中，进料在旋转轴的中心进入旋转模块。当流体流经转鼓时，固体会积聚在转子腔的外壁上。在腔室的顶部，堰将浓缩浆液和澄清液体分向两个不同的出口，从而实现连续分离。澄清的液体沿着堰的内侧流出，而浓缩的浆液从堰的外侧流出。分离的液流都遇到向心泵，向心泵产生压力以驱动流体从转子流出。一系列同心管允许入口和两个出口都位于模块的顶部。Unifuge 的操作与 U2k 类似，但不能连续去除浓缩物，适用于灌流培养和细胞建库。
原文：W.A.Dryden, L.M.Larsen, D.W.Britt, et al., Technical and economic considerations of cell culture harvest and clarification technologies. Biochemical Engineering Journal, 167 (2021) 107892.
相关阅读：