用作下一代药物递送平台的细胞外囊泡：生产和规模放大
基于细胞外囊泡（EV）的细胞间通讯在所有生命中都是保守存在的。已经有令人信服的证据表明，细胞外囊泡参与主要（病理）生理过程，包括细胞稳态、感染传播、肿瘤发展和心血管疾病。各种研究表明，与传统的合成载体相比，细胞外囊泡具有多个优势，为现代药物递送开辟了新的前沿。尽管进行了广泛的研究，但基于细胞外囊泡的疗法的临床转化仍然具有挑战性。原文讨论了细胞外囊泡的独特性以及利用其作为药物载体的全部潜力所需的关键设计和开发步骤，包括载药方法、深入表征和大规模生产。
EV生产和规模放大
虽然胞外囊泡（ EV）的生产有望从其它领域的知识中获益，包括在蛋白质生产方面的丰富经验以及不断增加的细胞治疗专业知识，但以下所述单元操作是EV 生产所独有的，因此值得特别关注（下图）。
载药EV生产过程中的工艺步骤和关键单元操作。上游工艺可以适应针对细胞疗法的细胞生产中使用的安全和质量概念，而下游工艺可以部分适应生物药生产中使用的概念。EV分离和纯化是独特的，本质上很容易受到病毒污染（上游和下游工艺过程中的无菌性问题使用感叹号表示），因为EV和病毒具有相似的胶体特性，并且大多数纯化工艺最初是针对病毒的纯化而开发的。
关键单元操作：上游。EV 来源的细胞培养和表征。EV生产可以从经典生物药（即抗体和蛋白质生产）和细胞疗法的发展中获益。宿主细胞选择和培养条件构成了关键的上游工艺步骤。目前，对于EV生产的最佳技术尚无共识。需要根据 EV 的活性和组织归巢特性以及潜在的免疫原性和致癌性考虑来选择亲代细胞。此外，遗传稳定性、宿主细胞杂质（如病原体，尤其是病毒）和EV 产量在亲代细胞选择过程中起着重要作用。一旦选择，这些宿主细胞将被培养以有效地生产具有正确表型的EV。建议的方法包括多层培养瓶、生物反应器。对于小规模生产，细胞可以在摇瓶、转瓶、滚瓶、波浪式培养袋或生物反应器中扩增。对于大规模细胞培养，细胞可以在不锈钢生物反应器（最大20,000 L 规模）、摇摆式波浪培养袋（最大 500 L 规模）甚至一次性生物反应器（最大 2,000 L 规模）中培养。从工艺安全的角度来看，封闭系统是首选；然而，这些系统比开放系统更难监控。需要按照生产生物药和细胞疗法的工厂中使用的方案密切监测遗传漂移和污染。越来越多的证据表明，牛奶源性EV 可能是获得大量生物相容性囊泡的有效替代来源。尽管使用牛奶EV 作为药物载体的可行性研究正在进行中，但从复杂牛奶中大规模分离纯化囊泡的工艺仍需要优化。
生产技术选择示意图。a. 细胞来源和相关风险的考量。b.基于 EV 收率和纯度考量的分析方法。DGC，密度梯度离心；SEC，体积排阻层析；TFF，切向流（错流）过滤。c.基于载入效率和大规模生产成本考量的药物载入方法。d.潜在污染物和杂质的大小和密度，其将被定量检测和去除。HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；UF，超滤。e.最终EV产品的制剂和储存方法以及这些方法对EV质量的影响。RT，室温。f.成功EV 介导药物递送的彩色编码指南。用于药物递送的EV 开发涉及大规模分离和表征的选择、免疫原性和生物分布模型的评估、药物装载和功能化、脂质体比较物的选择、制剂/储存和批间差异的评估。关于支持潜在临床前开发的每个部分中的考虑的技术和文献证据的当前状态用颜色表示。在相对规模上，“高”意味着文献中的全面例子和实质性的技术发展，“中”意味着需要在持续努力的基础上进一步研究，“低”意味着需要更多的基础和比较研究。该图表明，没有任何部分的研究达到最高水平，在开发更标准化和更大规模的方法以使基于EV 的载体更接近临床转化之前，仍需要进行更多的科学评估。
可选的内源性载药。可以对亲代细胞进行工程改造，以提高EV的产量和/或生产具有增强特性的EV。已经对几种用不同分子载药EV 的方法进行了实验评估。这些方法包括(1) 内源性技术，其中产生 EV 的细胞还可为囊泡配备药物载荷或修饰的结构蛋白/RNA 成分，以及 (2) 外源性方法，其中药物在分离后加载到EV 中。如果生产细胞直接脱落含有所需分子的EV，则内源性载药技术的复杂程度较低。内源性载药方法也已用于将基于纳米颗粒的药物包封到EV 中。由于载入效率通常是有限的，因此可以对细胞进行基因工程处理以生产含有所需活性成分的EV。然而，这种方法仅限于生物可及的药物，例如核酸和蛋白质药物。最近，提出了一种光遗传学工程外泌体系统，该系统集成了蓝光响应膜模块，用于可控的蛋白质-蛋白质相互作用，将大量抗炎蛋白封装到 EV 中。虽然非常有趣，但生产EV 的细胞的基因工程导致比从原初细胞中分离囊泡更复杂的生产规模放大，并且没有分离后工程那么复杂。
EV收获和工程处理。制备的EV的产物分离和表征。对于 EV 分离，产物与细胞的初步分离可以通过完善的生物药分离方法完成，包括离心、深层过滤（机械筛分和吸附）以及切向流（错流）过滤。虽然已经评估了几种用于EV 分离和纯化的策略，例如差速超速离心(dUC)、沉淀、体积排阻层析、亲和层析和切向流过滤，但对于大规模生产的特定EV 的分离技术尚未达成共识。这种共识的缺乏主要是因为某些程序可能会对EV的完整性和质量产生负面影响。此外，不同方法及其报告的收率和产物纯度各不相同，总体EV 纯度普遍较低。此外，对于异质的 EV 种群，分离方法可能导致选择性分离一个特定亚群，其生物活性高于或低于总种群。密度梯度离心和dUC 在收率和纯度方面提供了不错的折衷方案。dUC被广泛接受为获得“纯”EV 的常用方法，尤其是在使用不含胎牛血清的化学限定培养基时。然而，仔细评估由培养基引入的人工制品至关重要，因为即使在这些条件下，核酸杂质的共沉淀仍是可能的。事实上，最近的研究表明，超滤和体积排阻层析（单独或组合使用）在收率和纯度方面都优于dUC。然而，根据所需的 EV 纯度，可能需要以牺牲收率为代价集成针对不同 EV 特性的正交纯化方法。这里，另一个内在问题出现了，因为目前使用的大多数纯化技术最初是为纯化病毒而开发的，而病毒是EV 最关键的潜在污染物之一。
最近，Barone 等全面分析了生物药生产中病毒污染的风险、成本和影响。一般生物药生产的病毒风险缓解策略基于三个原则：（1）通过选择低风险的起始和原材料以及使用生产控制来预防病毒进入；(2) 检测过程中的材料以确保它们没有病毒并能够拒绝批次；(3) 从产品中清除病毒污染物（通过灭活和/或去除）。虽然仔细选择细胞和原材料并进行检测（基于聚合酶链反应或体外病毒检测）都可以降低风险，但EV 的独特尺寸使得灭活和/或去除病毒污染物比其它生物制药产品更具挑战性。目前的策略是基于亲和而不是体积排阻。然而，多步骤下游工艺可能会严重地提高生产成本。除了与内容物（包括污染物）的完整表征相关的挑战之外，使用现有分析技术评估成分的空间和构象组织也极具挑战性。即使是成分或结构的微小变化也会强烈影响疗效和安全性。功能活性分析的使用至关重要，因为分离方法和其它EV种群或污染物的存在可能会决定性地影响产品活性和脱靶效应。
外源性载药。对于 EV 的临床转化，需要可重复且技术上可操作的方法来装载所需的药物。虽然脂质体的载药方法已经优化并应用于工业生产，但仍然缺乏针对EV的这种设置。外源性载药方法通过在孵育后药物与脂质双层膜的结合、将治疗药物附着到EV 表面以及通过机械或化学技术瞬时打开EV 膜以允许化合物扩散到囊泡中来被动地进行。暂时渗透膜的最常见方法包括超声处理、电转、皂苷处理和被动孵育。每种方法的优缺点取决于实验设置、药物类型和EV 的来源，并且可以缩放。被动孵育是一种非常简单的方法，其中纯化的 EV 与药物一起孵育，以允许掺入囊泡膜中。
许多早期的载药方案都遵循这种方法，因为它在掺入疏水性化合物（如姜黄素）方面表现出优异的性能。然而，通过EV 膜被动掺入负载的药物的稳定性仍不清楚。对于亲水性化合物，可以通过添加皂苷来增强负载，这已被证明对大蛋白质有效。皂苷是温和的表面活性剂，可引起瞬时的膜不稳定性，也可能影响生物分子；因此，当皂苷大规模使用时，需要注意纯化。用于渗透EV 膜的机械方法，例如电转或超声处理，已被证明对小分子和大分子都是成功的策略。尽管这些方法可以规模放大，但它们对蛋白质和核酸药物的潜在影响需要仔细考虑。除了关注维持生物大分子的稳定性外，药物的大小在EV 载药过程中提出了另一个挑战。使用皂苷预处理已成功地将> 200 kDa 的大型酶加载到 EV 中。由于可以外源封装到 EV 中的核酸的大小也受到限制，有研究开发了一种用于大规模生产功能性EV 的细胞纳米穿孔方法。这种方法提高了EV 产量和信使 RNA 负载；然而，所需的额外转染和电刺激步骤使其工业应用相对困难。
最近，有研究提出了一种基于脂质体融合的替代方法。含有融合脂质的脂质体与EV 一起孵育，合成脂质体的载荷与EV 合并。这种方法可以在不损害 EV 膜的情况下为有效载入更大的分子铺平道路。
下游。纯化。除了载药前的 EV 分离和纯化步骤外，可能还需要额外的纯化步骤来去除游离药物并排除工艺过程中引入的潜在污染物。由于所得产物的高纯度，磁珠免疫亲和纯化越来越受到关注。然而，其通常只能获得较低的收率，虽然理论收率可能存在因为污染物而被低估的情况。
质量控制 – 工程化EV的表征。对于常规生产和产品监控，需要定义关键质量属性。评估这些属性的方法可能包括评估亲代细胞特性（例如，评估活性和表面标记表达，以评估表型）、EV特征（例如，评估数量、粒径和表面标记表达），评估微生物污染（例如，检测内毒素和支原体）和（特定于应用的）功能活性。对于批间差异的评估，我们建议使用类似于针对生物仿制药的概念 - 产品的分析特征应与参考产品的分析特征高度相似。虽然非细胞培养方法（例如从血浆或牛奶中分离）为细胞培养提供了有趣的替代方法，并可能可获得大量EV，但这些来源含有来自各种细胞类型且难以简单分离的EV。因此，EV功能活性的表征对于量化在靶和脱靶效应更为重要。
制剂和储存期限。最近的研究集中于EV 的制剂和储存条件（例如，-80 °C vs. 4°C），包括评估 EV 的大小、电荷和数量，但尚未发现强相关性。研究已显示 4 °C 下的存储会导致 EV 结构的聚集和损坏。此外，即使EV 的大小和数量在 -80°C 时保持不变，但仍检测到生物活性的变化。冻干已被研究作为长期储存的替代方法；然而，它在复溶过程中对囊泡完整性的影响取决于冷冻保护剂的使用。尽管建议在-80°C 下储存，但它是物流上最具挑战性且成本最高的方法。
源于设计的安全 & 降低工艺风险。虽然几年前 EV 的哺乳动物细胞来源是其临床转化的主要障碍，但在基于细胞的治疗方面已经取得了相当大的进展。在安全性方面，源自自体细胞的EV 的风险低于源自异体细胞（包括细胞系）的EV。然而，生产自体 EV 所需的时间通常与开始治疗的可用时间不相容。在患者特异性的 EV 生产和质量控制所需的时间内，患者的临床状况可能会恶化，从而无法进行个性化产品的给药。尽管有几个制药公司开发和商业化的自体产品的例子，但目前的框架似乎主要适用于小规模的学术生产，而不是大规模的药品生产，而且生产成本可能过高。虽然使用异体EV 通常是可行的，但需要谨慎进行亲代细胞的选择、免疫和致癌效应的评估以及通过持续监测将病毒污染的风险降至最低。选择用于监测的分析方法，特别是它们的灵敏度，是确定基于EV 的药物载体的临床转化所需时间的关键挑战。监管机构尚未发布有关如何检测这些EV的安全性和效力的指南。目前，EV采用逐批检测的方式，每个实验室和公司使用不同的检测方法。
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原文：I.K.Herrmann, M.J.A.Wood, G.Fuhrmann, Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nature Nanotechnology, 2021, 16:748-759.
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