【药化】JACS：利用CyLBam平台探针可视化ADC药物连接子裂解的位置和深度

导读：

最近，美国国家癌症研究所Martin J. Schnermann课题组利用组内合成和优化出的、能显示改善细胞渗透性和溶酶体积累的norcyanine化合物，设计出一种CyLBam（cyaninelysosome-targeting carbamate）平台探针，可用于可视化检测出ADC药物连接子在小鼠体内裂解的位置和深度。该方法在细胞、组织和活体中都能进行检测，适用于单抗靶向可激活成像。作者同时发现蛋白酶可切割的肽连接子在实体瘤中的裂解效果比二硫化物连接子好。相关研究成果发表在近期的《美国化学会志》上（J. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.1c10482）。

背景介绍（Figure 1）：

（Figure 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

抗体药物偶联物（ADCs）是一种结合了单克隆抗体（mAbs，简称单抗）特异性和小分子药物强效性的新型生物大分子药物。目前为止，FDA批准了10款ADC药物，另有超60款ADC药物处于临床测试阶段。ADC药物活性的表达需要连接子在溶酶体中裂解以释放有效药物载体。因此，连接子需要满足两个条件：1）在血液循环中稳定；2）到达靶标细胞时能够发生选择性裂解。对ADC连接子的定量分析具有重要的应用价值。虽然肿瘤杀伤活性检测和毒性分析可以对ADC药物进行评估，但是这两种重要方法只能间接分析出药物的释放位置和机理。酶联免疫吸附测定法（ELISA）虽被广泛应用，但仅限于测试抗体成分的血池浓度和生物学分布。放射性标记方法能识别出单抗的分布位置，但价格昂贵且不能直接识别出连接子的裂解。

光学成像技术有助于ADC药物的设计和优化。先前有许多科学家研究利用常规可见光刺激响应荧光发色团来量化细胞成像实验中的有效载荷和内化动力学。但因为可见光穿透深度差，并不适合检测复杂组织。作为补充，近红外“turn-ON”型探针在识别复杂组织中生物现象的动态分布方面具有重要潜力，可以识别肿瘤和脱靶。美国国家癌症研究所Martin J. Schnermann课题组在今年4月份报道了基于七甲川花菁核（heptamethine cyanine core）的CyBams（cyanine carbamates，Figure 1A）平台探针（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 5674−5679）。该探针具有独特的开启频率，能够可视化体内转移瘤模型中靶标的动态变化。最近，该课题组进一步发展了一种CyLBam（cyanine lysosome-targeting carbamate）平台探针（Figure 1），能够通过近红外成像技术可视化ADC药物连接子在小鼠体内裂解的位置和深度。

Norcyanine信号的优化（Figure 2, Table 1）：

（Figure 2，来源：J. Am. Chem. Soc.）

在探索单抗连接子体内成像前，作者首先对CyBam平台产生的活性产物：一种对pH敏感的norcyanine化合物的细胞信号进行优化。虽然已报道的磺化norcyanine Sulfo-NorCy7（Figure 2A）能够提供高对比度成像，但得到足够高的体内信号需要较高浓度（20−40 μM），从而限制了该方法的使用。为了解决这个问题，作者设计并合成了如Figure 2A所示的5个新的norcyanine化合物Pip-NorCy7、H-Nor-Cy7、N-Me-Pip-NorCy7、OMe-NorCy7、N-Me-NorCy7，并和已知的Sulfo-NorCy7一起测试光物理特性和细胞摄取率。如Figure 2B、Figure 2C和Table 1所示，6个探针的吸收和辐射波长都超过700 nm，pK_a值在4.4-5.8。由Figure 2D的体外流式细胞术定量分析和Figure 2E的共聚焦显微镜成像可以得出，四级胺基能增强溶酶体的摄取和保留能力，显著增强荧光信号，其中N-Me-NorCy7是最优化合物。因此，作者接下来将N-Me-NorCy7和已报道的Sulfo-NorCy7分子进行可活化单抗偶联物生成对比。

（Table 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

单抗靶向成像（Figure 3）：

（Figure 3，来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了评估上文优化出的去甲花菁化合物对单抗偶联物信号的影响，作者分别将N-Me-NorCy7和Sulfo-NorCy7化合物和Figure 3A中的VC和NC片段连接起来，组成2个CyLBam探针和2个CyBam探针。这四个探针再和抗体帕尼单抗组成偶联物，并通过离心柱和透析法纯化得到四个偶联物Pan-VC-CyLBam、Pan-NCCyLBam、Pan-VC-CyBam、Pan-NC-CyBam。作者首先在体外肿瘤细胞MDA-MB-468（表皮生长因子EGFR+）和MCF-7（表皮生长因子EGFR−）中对比这四种探针的荧光信号。Figure 3B的共聚焦显微镜成像和Figure 3C的体外流式细胞术定量分析都显示，Pan-VC-CyLBam偶联物是荧光信号最强的探针。作者接着在小鼠体内肿瘤细胞MDA-MB-468中对比这四种探针的荧光信号。Figure 3D的肿瘤-背景比率图和Figure 3E的注射后48小时活体成像系统（in vivo imaging system）荧光图像也都显示，Pan-VC-CyLBam偶联物是荧光信号最强的探针。作者认为此结论有助于接下来的一系列ADC连接子评估。

ADC连接子的定量对比（Figures 4, 5）：

（Figure 4，来源：J. Am. Chem. Soc.）

研究最广泛的ADC连接子包括两类：1）二硫化物连接子，可以被生物硫醇还原切割；2）肽连接子，可以被溶酶体组织蛋白酶切割。这两种连接子研究工作众多，在上市的ADC药物中也都有应用。然而，在目前已报道的研究工作中，没有直接对比这两种连接子的有效载体在实体瘤环境中的裂解情况。为了解决这个问题，作者设计了两种常见的组织蛋白酶可切割的肽连接子：Pan-VC-CyLBam和Pan-AA-CyLBam，以及两种二硫化物连接子：Pan-S,S-Me₂-CyLBam和Pan-S,S-CyLBam，与已报道的Pan-NC-CyLBam连接子一起研究（Figure 4A）。Figure 4B的体外流式细胞术定量分析显示，在EGFR+细胞中孵化24小时，组织蛋白酶可切割的肽连接子裂解时的荧光信号比二硫化物连接子强。但在EGFR−细胞中则都比较低。因此作者进一步利用体内荧光图像来进行对比，结果显示Pan-VC-CyLBam、Pan-AA-CyLBam裂解时的荧光信号最强（Figures 4C-4D）。为了验证该方法的通用性，作者将VC和S,S-Me₂连接子和CD276靶向抗体m276-SL偶联成m276-SL-VC-CyLBam、m276-SL-S,S-Me₂-CyLBam偶联物。Figure 5的类似检测实验显示，m276-SL-VC-CyLBam荧光强度最好，可以和m276-SL-S,S-Me₂-CyLBam明显区分，从而进一步证明蛋白酶可切割的肽连接子在实体瘤中的裂解效果比二硫化物连接子好（Figure 5）。作者认为这一现象可能是由二硫化物连接子在血液循环中稳定性较差所致。

（Figure 5，来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：

总之，Schnermann课题组利用组内发展的CyLBam探针平台，设计了一种通用的近红外光学成像连接子分析检测方法。作者期待该方法能有助于ADC药物的研发。

论文信息：

Targeted Fluorogenic Cyanine Carbamates Enable In Vivo Analysis of Antibody−Drug Conjugate Linker Chemistry

Syed Muhammad Usama, Sierra C. Marker, Donald R. Caldwell, Nimit L. Patel, Yang Feng, Joseph D. Kalen, Brad St. Croix, and Martin J. Schnermann*

J. Am. Chem. Soc. DOI:10.1021/jacs.1c10482

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