皮下荷瘤看似简单，原来套路这么深（内附视频）
皮下荷瘤定义
肿瘤细胞系移植到同种或异种动物的皮下形成肿瘤块，荷瘤是将肿瘤细胞移植到小鼠体内的专业说法，皮下荷瘤属于肿瘤细胞系移植模型（CDTX），CDTX还包括各种转移模型荷瘤、原位荷瘤等。
皮下荷瘤应用
一般用于抑制肿瘤生长（细胞增殖）的药物的筛选检测。如果单独研究肿瘤在小鼠体内的生长，那么几乎所有的肿瘤均可通过皮下荷瘤进行实验研究。
第一部分：皮下荷瘤模型的几个考虑因素
（1）肿瘤细胞系的选择
肿瘤细胞株的选择，是一个很麻烦的问题，却是最重要的问题。有以下几点要求：
①不同肿瘤细胞系的成瘤率不同，需选取成瘤率高的细胞系；如乳腺癌细胞MCF-7，虽在体外应用多，但体内成瘤率差，生长慢，因此一般不选用；
②肿瘤细胞根据分子标记分为多种，考虑成瘤率外，选择时还需考虑实验目的，如针对药物靶点HER2，需要选择HER2高表达的肿瘤细胞如SKBR-3，而不是HER2阴性的MDA-MB-231；再如研究靶向kras突变肿瘤的药物，我们选取kras突变的（其突变类型又属于突变率比较高的），又易培养且成瘤率好的A549。
③实验用肿瘤细胞株多为人源或鼠源细胞系，根据实验目的选择，一般鼠源细胞系更易荷瘤，但是人源细胞系会更贴近人类肿瘤生长情况。
（2）小鼠品系的选择
由于肿瘤细胞系主要分为人源和鼠源，因此小鼠品系的选择要根据细胞系来源。
人源细胞系：为异种移植，应该选择免疫缺陷的小鼠（如：nude，NOD/scid，NSG，详情点击链接3.2 免疫缺陷动物（一）。
鼠源细胞系：为同种移植，选择与肿瘤细胞系来源一致的小鼠（C57BL/6品系来源的黑色素瘤细胞系B16F10就要选择C57BL/6品系的小鼠）。不过裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系统异常，不适用于筛选免疫调控药物。
（3）接种部位
应选择血管丰富且易操作的部位，如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位。其中腋下中部皮下较好，成瘤率高。如下图所示：
Balb/c小鼠腹股沟皮下荷瘤（鼠源结肠癌CT26）
第二部分：裸鼠皮下荷瘤步骤
一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系，然而由于存在免疫排斥，需选择裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠为例，为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程
⑴肿瘤细胞的传代扩增
取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增，确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态
⑵计算细胞接种量
根据经验，一般鼠源肿瘤细胞接种2～100万/只，而人源肿瘤细胞则需要200-1000万/只以上。当然最好结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量。
⑶准备裸鼠
一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤。每批实验只用同一性别动物，通常雌雄均可，但是根据研究的肿瘤类型及肿瘤细胞系选择（乳腺癌等要选择雌性，前列腺癌等要选择雄性）
⑷操作步骤（请观看视频）
①接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置；
②向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；
③针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；
④接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；
⑤注射完毕后，缓慢退出针头，尽量避免漏液；
⑥细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。
下面为皮下荷瘤视频（包括各个部位的注射手法）：
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=z05096y8c0q&width=500&height=375&auto=0
第三部分：后续实验安排
⑴分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；
⑵数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；
⑶给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；
⑷人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。
补充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步骤与裸鼠荷瘤一致，只是比较繁琐的是，由于野生型小鼠有毛发，所以需要剃毛（如上图Balb/c小白鼠腹股沟皮下荷瘤鼠源结肠癌CT26）
第四部分：皮下荷瘤的几点问答
⑴瘤子长不出来是怎么回事？
一方面可能是细胞状态差，活力不好，或是肿瘤细胞不易成瘤，需加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系；一方面可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞Nude裸鼠）
⑵小鼠瘤子长起来又消失？
肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，长不起来建议换鼠。
⑶均一性很差，肿瘤体积差距较大？
如果荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大，这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致，建议重新做实验分组。
⑷是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。
⑸是否应用免疫抑制剂加速肿瘤生长？
如果裸鼠荷瘤不生长，可以参考文献，用免疫抑制剂如环磷酰胺（抑制裸鼠NK细胞活性）促进生长；不过最好不要为了缩短造模周期来加速生长，因为可能会造成溃烂，这样就不得不中止实验。所以一般情况下，应尽量符合细胞系本身的生长特性，不应过多地人为的干扰。
皮下荷瘤实验介绍就到此结束了，原来看似简单的实验却有多种不可忽视的因素需要考虑。简单回顾一下，皮下荷瘤模型中细胞系和小鼠品系是最需要考虑的两大因素，切记一定要多查阅文献并结合预实验，进而找到最合适的皮下肿瘤模型。
视频和图片提供者：齐亚磊
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