从mRNA药物分子设计到免疫反应------聊一聊基于mRNA的癌症疫苗（完整版）

在2020年之前，提到疫苗大家可能只会想到灭活疫苗、病毒载体疫苗，而在COVID-19肆虐全球之后，相信所有人都了解到了一个疫苗新品种----mRNA疫苗。在2020年，Moderna与BioNTech以史无前例的速度推动了两款新冠疫苗的研发与上市，让上亿的人群免受COVID-19的重症侵害。同样的，mRNA疫苗技术也为治愈癌症提供了新的武器，本系列文章小编就带大家从药物分子设计到免疫反应等方面聊一聊基于mRNA的癌症疫苗。

一、mRNA药物分子设计

在十年之前，大家对mRNA疗法并没有投入大量的关注，这主要是有以下三点的考量：① mRNA 非常的不稳定，极易被降解；②外源的mRNA进入到细胞内，会有很高的先天免疫原性；③ mRNA在体内的递送效率非常低下。但在在过去的十年中，重大的技术创新和研究投入使mRNA成为疫苗开发和替代蛋白质治疗领域的非常前景的治疗工具。

1. 新的mRNA的5’ Cap 加帽方法

在真核生物中，mRNA的 5ʹ Cap可以对mRNA的转录后剪接、核输出、蛋白的翻译起始以及对抵御核酸外切酶的降解等多个方面进行调控，并且5ʹ Cap还可以为先天免疫系统去标记来源于机体自身的RNA，从而使这些RNA免于被攻击。真核生物的 5ʹ Cap是一个7-甲基鸟苷 (m7G)，它通过三磷酸桥连到第一个核苷酸上，所形成的结构被称作Cap 0。在细胞内，Cap 0 已经可以募集翻译起始因子并防止 mRNA 的降解。mRNA的第一个核苷酸的2ʹ-羟基会被甲基化，从而生成Cap 1。在约 50% 的转录产物中，mRNA第二个核苷酸的2ʹ-羟基也会被甲基化，从而形成Cap 2。另外，通常mRNA的第一个核苷酸是腺苷，并且这个腺苷的N6会被腺苷甲基转移酶（目前推测是与RNA 聚合酶 II相互作用的一个因子）甲基化，从而形成m 6 A m cap。因此，除了 cap 0之外，成熟的真核 mRNA至少还含有三种内源性帽结构：cap 1、cap 2 和 m 6 A m cap。哺乳动物免疫蛋白如 RIG-I 和 IFIT 可以识别异常加帽的 RNA，其中RIG-I 识别未加帽的 5ʹ-三磷酸 RNA 或 cap 0，然而RNA的cap 1 修饰则可以消除 RIG-I的 信号传导。IFIT 蛋白可以识别缺乏  2ʹ-O-methylation（Cap 1）的RNA，并结合在它们的 5ʹ 末端，进而通过与翻译起始因子竞争结合RNA的方式来阻止病毒的翻译。因此在功能方面来说，cap 1 的结构可以将 mRNA 标记为“自身 RNA”。cap 0 RNAs 相对于cap 1 RNAs 只显示出很小的体内活性，另外，约有50% mRNA 具有 cap 2 结构，约有30-40% mRNA 具有m 6 A m cap结构，目前cap 2 的功能仍不清楚，m 6 A m cap可能可以利用专门的翻译起始因子来增强蛋白翻译。

几种5’ Cap 的结构

目前主要有两种方法可以在体外产生加帽的RNA：

第一种方法是在转录后使用牛痘病毒加帽酶对 RNA 进行加帽，从而产生带有 Cap 0 或 Cap 1 的RNA。之所以会产生Cap 0 或Cap 1，这是因为 ①加帽酶有鸟苷转移酶活性，可以将底物中的m7G帽子加到RNA的5′-三磷酸末端，产生Cap 0； ②加帽酶有甲基转移酶活性，可以将底物SMA中的甲基，转移到起始核苷酸的 2'-O 位置，产生Cap 1。加帽反应非常高效，但它在扩大生产规模的过程中，会额外添加2'-O-Methyltransferase以增加 Cap1的加帽率，因此整个体系会更昂贵也更加复杂。并且通过酶促反应是不能产生Cap 2 或者m 6 A m  cap的。

利用牛痘病毒加帽酶对 RNA 进行加帽

第二种方法是通过在转录过程中，加入过量的Cap类似物来进行加帽。① 传统的Cap类似物包括GpppG和 m7GpppG 等。在体外转录的起始过程中，噬菌体的RNA 聚合酶通过m 7 GpppG 中鸟苷的3'-OH对DNA模板编码的下一个NTP的α-磷酸进行亲核攻击来启动转录。但是，这种亲核攻击也有可能由m 7 GpppG的3'-OH发生，即第二个核苷酸连接到了帽子鸟苷的3'位置，从而致使只有50%的转录产物有正确的帽子（正确的加帽是m 7 GpppGpNpN ，错误的加帽是Gppm 7 GpNpN… ）。这种反向加帽的转录物直接降低了50%的 mRNA 的整体翻译活性。② 因此在这个基础上，科研人员开发了抗反向帽类似物ARCA (anti-reverse cap analog)，ARCA是在 m 7 G 中引入带有 3'-O-甲基、3'-H 或 2'-O-甲基的修饰，从而确保了加帽后NTP连接的正确方向。通过ARCA加帽后可以形成 Cap 0，但是加帽的效率略低（70%加帽mRNA/30%三磷酸mRNA）并且加入ARCA的体外转录产量低（由于在体外转录中，为了避免GTP与ARCA竞争结合，因此使用的 GTP 浓度较低，从而降低了整个反应的产量，以致最终产量约为1.5 毫克mRNA/毫升转录产物）。③ 此外，在转录时使用CleanCap，也是目前十分常见的做法。ARCA是使用二聚体 (m 7 GpppG) 起始T7 启动子的转录，而CleanCap是使用三聚体 (m 7 GpppA m G) 启动（目前也有m 7 GpppA m U、m 7 GpppG m G等版本；对于ARCA来说，它可以在Cap 0 的2’ 3’位置进行修饰，从而使NTP无法反向插入。但是ARCA无法在第一位G的3’ 进行甲基化修饰-暨无法加入Cap 1，因为这会使NTP无法在3’位置正向插入。而CleanCap是三聚体的形式，它已经将Cap 0、Cap 1 整合在了一起，并且末位的G是未加修饰的，因此可以使NTP在G的3’位置正向插入）。由于 T7 RNA 聚合酶非常偏好以GTP 起始，因此酶促加帽或 ARCA 加帽的 RNA ，都会以 5ʹ-G开始。但 T7 聚合酶与CleanCap结合后，对起始的5ʹ 核苷酸的使用是无偏好的，因此它可以以各种核苷酸来起始序列的转录。这种方法产生高度加帽的 RNA，产量更高（转录约 4 毫克/毫升）。并且CleanCap 方法可以产生 cap 0、cap 1、cap 2 或m 6 A m加帽的 mRNA。

利用Cap类似物对 RNA 进行加帽

2.  新的核苷酸修饰方法

另一种可以提高 mRNA 稳定性和翻译效率的方法是对mRNA进行替代核苷酸修饰 。其实在自然界中，很多RNA都发生了转录后修饰，尤其是tRNA ，可能大约有五分之一的核苷酸含有 RNA 修饰。目前已确定的RNA合成后修饰多达150多种，而在mRNA中常用的核苷酸修饰策略是在体外合成mRNA时，利用假尿苷 (Ψ)、1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 和 5-甲基胞苷 (m5C) 替代天然尿苷和胞苷来进行转录反应。利用修饰核苷的优势主要体现在以下几个方面：①当单链 mRNA 分子被外源性递送至细胞时，他会被细胞本身判定为Pathogen-associated molecular pattern。单链 mRNA及其降解产物会被Toll 样受体 7 (TLR7) TLR3和 TLR8 识别，从而激活先天免疫系统的细胞，产生高水平的TNF-α和 IFN-α。而利用假尿苷等替代天然的尿苷，则可以避免这一点。假尿苷是 RNA 中最常见的修饰，并且哺乳动物存在假尿苷修饰的 mRNA 代谢和随后排入尿液的自然途径，因此这可能是假尿苷具有较低免疫原性的原因。②假尿苷修饰后的mRNA稳定性有所增加，从而可以起到增强翻译的效果。有文献报道过，当mRNA的尿苷被假尿苷取代时，它对磷酸二酯酶的水解具有更高的抵抗力。并且假尿苷可以通过促进碱基堆积来稳定 mRNA的二级结构，从而减缓在体内的降解。

对mRNA的核苷修饰可以降低其免疫原性、增加稳定性与翻译效率

3. 对mRNA分子的其他优化

效载荷来增强。mRNA的表达盒由多个元件组成，包括 5' 非翻译区 (5' UTR)、蛋白质编码区、3' UTR 和多聚腺苷酸化 (PolyA) 信号。 

①对UTR区域的优化。在 mRNA 的非翻译区 (UTR) 内存在多个调控元件，这对于 mRNA 的稳定性和蛋白翻译的效率都非常重要。譬如有的5' UTR 上的RNA 元件可能会改变其二级结构（例如，内部核糖体进入位点 [IRES]、上游起始密码子[uAUG] 或上游开放阅读框 [uORF]），从而影响核糖体在起始密码子附近与mRNA的结合，进而发挥调节翻译效率的作用。3' UTR则是mRNA 分子的细胞内动力学的关键调节因子之一，它在长度上会有一个最优范围，具有较长 3' UTR 的 mRNA的半衰期较短，而具有较短 3' UTR 的 mRNA 翻译效率则较低。目前科研人员对  UTR 序列与相关蛋白质表达水平之间关系的了解有限，因此很难做到对UTR 的从头设计，所使用的也往往是天然的UTR。譬如说 β-珠蛋白的5'-和 3'-UTR 可以明显提高翻译效率， α-珠蛋白的 3'-UTR则可以稳定mRNA，非洲爪蟾 β-珠蛋白 5'- 和 3'- UTR 、TEV的5'-UTR和人热休克蛋白 70 的 5'-UTR等同样被发现可以提高mRNA 的翻译效率。目前mRNA 治疗中常用的 3' UTR 多来源于 α 和 β 珠蛋白，这是红细胞中最丰富的蛋白质，它在细胞中可以增加 mRNA 半衰期的能力已经得到了多次的验证。另外通过算机遗传算法，对海量的UTR进行机器学习从而构建新的合成型UTR或将几个UTR组件相互组合已达到更好的效果，也是目前很有前景的方向。

mRNA的5’ 3’ UTR区域

②对mRNA的蛋白质编码区进行序列优化，同样是一个重要的步骤。蛋白质编码区的序列，不但会影响翻译效率、蛋白质折叠还同样会影响 mRNA 的丰度。因此在进行序列优化时需要考量多个参数，例如序列中的GC含量。尽管富含 GC 的序列可能对 mRNA 的二级结构形成产生影响，但富含 GC 的序列的翻译效率可以比富含AT的序列的翻译效率高 100 倍 ；另外翻译延伸率的高低取决于密码子相应 tRNA 的可用性，因此避免使用稀有密码子是密码子优化的主要内容；此外，密码子优化对于 mRNA 稳定性也同样十分重要，因为由密码子决定的翻译延伸率，是影响mRNA稳定性的主要因素。 有文章显示 ，使用稀有密码子会降低 mRNA 的翻译延伸效率，进而会导致募集 DEAD-box RNA 解旋酶 Dhh1p，从而触发 mRNA的降解。目前还有一些实验室利用生物信息学方法，对mRNA的序列进行深度学习，从而设计方法在不影响氨基酸序列的情况下，优化mRNA序列，并增强其稳定性。例如Hannah等人将 RNA 分子的降解率与RNA碱基未配对概率 (AUP) 的平均值联系起来，他们发现如果AUP 减少 2 倍则会使 mRNA的 半衰期增加 2 倍。因此重新设计 RNA 序列以形成双链区域，以改变二级结构的方式来减少mRNA降解，也会是mRNA优化的重要策略。

③对mRNA进行poly(A) 加尾。poly(A) 尾是大多数成熟哺乳动物 mRNA 的 3' 末端的一段腺苷酸残基。哺乳动物成熟mRNA 的 poly(A) 尾由几十个到300个腺苷残基组成，它可以与多聚（A）结合蛋白 (PABPs) 形成细胞质核糖核蛋白 (RNP) 复合物。这种相互作用对于高效翻译和控制 mRNA 稳定性是非常必要的。当mRNA 到达细胞质，poly(A) 尾核糖核蛋白复合物与 5' 帽协同作用，可以和 eIF4F 复合物形成稳定的闭环结构，从而促进翻译起始。因此，poly(A) 尾的存在对于有效的蛋白质表达是必不可少的。另外，poly(A) 还可以通过防止外切酶降解来稳定 mRNA 分子。因此，去腺苷酸化率在很大程度上决定了 mRNA 的半衰期。将细胞质中的 poly(A) 尾缩短至小于 15–20 nt 会破坏poly(A)与最后一个 PABP 的相互作用。一旦最后一个 PABP 被释放，mRNA 就会变得不具有翻译活性并且易于降解。

poly (A)尾巴与蛋白翻译的起始

对于体外转录的 mRNA，poly(A) 尾可以编码到 DNA 模板（既可以是PCR 产物，也可以是质粒）中，也可以在体外转录后通过酶促反应添加到 mRNA 中。虽然 PCR 提供了很大的灵活性并可以广泛用于小规模 mRNA 生产（几百毫克）中，但高生产成本和 PCR 扩增过程中的突变风险限制了其在大规模生产中的应用（几克）。另一方面，目前质粒的生产工艺已经非常成熟，与基于 PCR 的模板制备方法相比，质粒制备具有较低的生产成本和较低突变风险。然而，poly(A)片段在质粒DNA在细菌内的扩增过程中容易发生重组，进而产生序列缺失的突变体。虽然模板编码poly(A) 尾的方法有以上的不足，但在工业上也要比酶促价位方法更有优势，例如模板编码可以产生确定且可重复的 poly(A) 长度，从而保证了产物的一致性。而酶促反应生成的poly(A) 长度不同，最终产品的组成难以控制，因此可能不符合监管要求 。目前，在工业生产mRNA疫苗的poly(A) 尾有几种不同的形式。例如使用长度为 101 nt 的 poly(A) 尾，120 nt 的poly(A) 尾或者分段式的120 nt poly(A) 尾等等。

当然，本章节还应该有一个重要的内容就是新的mRNA递送载体，这也是让mRNA疫苗大出风头的最关键因素。不过相信大家已经看到了好多的关于mRNA递送载体设计、专利纷争的文章，因此小编在这里就不一一赘述了。小编在参考资料中提供了两篇吃瓜文章，欢迎大家品尝。

二、mRNA疫苗在体内的免疫学作用

T细胞依赖性B细胞活化

对预防性疫苗例如新冠疫苗、乙肝疫苗来说，他们的保护机制主要是依赖于中和抗体反应：注射疫苗，生成抗体，抗体会与宿主细胞表面的病毒受体（例如ACE2）一同竞争病毒抗原表位，并以此阻止病毒吸附到宿主细胞表面，与此同时，由于病毒表面挂满了抗体，则可以达到抗体中和作用或被被巨噬细胞等识别，进而被清除掉。在细胞层面上，mRNA 疫苗通过肌肉内注射给药后，会在注射部位的细胞中表达其所编码的抗原。这些表达出的抗原会被一些迁移到注射部位附近淋巴管道的APC（有报道主要是巨噬细胞，但也有文章说多依靠DC）等摄入体内。做为外源蛋白，这些抗原会被运送到溶酶体中，再介用MHC-II传递给+CD4细胞，促其成熟，这些激活的辅助性的T细胞， 尤其是滤泡辅助 T 细胞会产生白细胞介素 21 (IL-21) ，并帮助 B 细胞分化和记忆 B 细胞的产生。与此同时，注射进组织的LNP 也会被转运到引流淋巴结中，进而由APC细胞摄取，并在APC中表达抗原。此时的抗原，既可以与B细胞的BCR相结合，又可以被B细胞内吞后介用MHC-II传递给+CD4细胞。召唤来的Th细胞，在被激活后可以分泌细胞因子，促进B细胞分化为能够生成IgG、 IgA、或 IgE的成熟B细胞。进而促进germinal center (GC) reaction，完成亲和力成熟，产生针对mRNA疫苗编码的高滴度、高亲和力抗体。

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗引发的免疫反应

然而治疗性疫苗尤其是癌症疫苗的保护机制则略有不同，它需要激发T细胞反应，尤其是需要激活CD+8 细胞毒性T细胞并由其完成对癌细胞的特异性杀伤。在注射 mRNA 疫苗后，mRNA可以直接在注射部位细胞内翻译表达目的抗原，这个过程与自然界中DNA/RNA病毒感染的过程及其对免疫反应的连续诱导非常相似。为了有效地诱导适应性免疫反应，在细胞内（主要需要依靠APC，尤其是DC）翻译后的抗原需要通过MHC I 类 和 MHC II 类分子来进行抗原呈递。APC 具有将细胞外抗原通过MHC-I（通常细胞外抗原会通过 MHC-II 呈递给 CD4+ T 细胞）交叉呈递给 CD8+ T 细胞的独特能力，这样可以有效地帮助刺激信号从 CD4+ T 细胞传递到 CD8+ T 细胞。由此产生的CD4+T细胞对CD8+T细胞的诱导效应即交叉引发已被证明对于诱导 CTL 和 B 细胞反应很重要，因此这也是mRNA肿瘤疫苗的一个重要优势。

为了有效地激活T 细胞、诱导免疫反应，几个额外的刺激信号是也是关键因素：除了抗原识别信号外（相当于TCR 与肽-MHC 复合物的结合），还需要有共刺激信号，以及随后连续产生的细胞因子来辅助。① 由APC提供的共刺激信号：在自然条件中，APC 在感知到病原体相关分子模式 (PAMPs) 后可以表达共刺激信号（如 B7 分子、CD70分子、CD137分子等，在向CD4+ T细胞进行抗原提呈时，B7分子可以与T细胞表面的CD28结合，促进T细胞与APC的识别与激活反应；而针对CD8+T细胞，承担这一作用的是CD70分子等），已表明机体受到微生物感染或危险。而这一过程，可以通过利用 Toll 样受体 (TLR) 配体来实现。TLR 属于先天免疫系统固有的模式识别受体 (Pattern recognition receptor)，其功能就是用来检测 PAMPs。因此，TLR会分布于细胞中各种潜在的病原体进入位点，例如TLR2/1、TLR2/6位于细胞膜上，TLR7/8/9位于内体膜上等等。它们对外源RNA分子的识别，会引起APC细胞表达共刺激信号分子。② 细胞因子：常见的细胞因子如IFN1，对于免疫反应也是有极大的促进作用的。在自然条件下， APC会因病毒或其他病原体的PAMPs的诱导而表达细胞因子。同时这些细胞因子的表达，会促进APC的的成熟并加强APC的抗原交叉呈递。总的来说，T细胞会在同时接收到T细胞识别抗原后传来的信号1和结合共刺激分子后传来的信号2时，会被这两个信号所激活。然而，仅接收信号1对T细胞来说是一个关闭信号，T细胞会转化成tolerance、clone incompetent 或 deletion的状态。

T-cell two-step priming model

对于mRNA疫苗来说特别有意义的一点是，通常外源性的 mRNA被认为是具有免疫原性的，因为它本身就是一类PAMP，可以通过 TLR（特别是 TLR3 、TLR7 和 TLR8）激活先天免疫细胞。一旦 PRR 感知 PAMP，先天性炎症反应（包括释放IFN1）就会随着适应性免疫反应的连续激活而启动。更准确地说，在APC 中，TLR 与mRNA相识别，会诱导产生多种促炎性细胞因子例如 TNF-α、IFN-α、IL-6、干扰素-γ 诱导的蛋白 10 (IP-10) 等，并会诱导产生共刺激信号。从而满足了关键因素中的①与②。而这一系列反应最终会引发适应性的 B 和 T 细胞反应。

mRNA疫苗对免疫系统的影响

通常，传统疫苗注射部位包括肌肉、皮下组织，mRNA疫苗还有一些非传统的注射部位，如结内、脾内、皮内、鼻内、静脉内和肿瘤内等。不同的注射部位、给药途径，会使疫苗被不同类型的细胞吸收，而其中有效性的关键点是看所选用的途径是否能有效地将目标抗原递送至淋巴组织内的APC中。目前来看，并不是非要将DC分离出来，然后用mRNA直接转染才能够有效的诱导免疫反应。将mRNA 注射到次级淋巴组织 同样有助于将抗原靶向递送至 APC，且无需 DC 迁移。肌肉内和皮内注射mRNA疫苗也有可行性，如果相比与静脉注射，会引起更持久的蛋白质表达。

①如果将mRNA疫苗直接注射到淋巴结中，APC可以直接通过胞饮作用吸收mRNA，并且由于节内有大量可用的免疫细胞，因此可以有效地产生 CD4+、CD8+ T 和 B 细胞反应，一些临床前和临床研究已经采用了结内注射的方法并证明这是一种非常有效的 mRNA疫苗的递送方式。很多离体的DC在经过mRNA转染后，也会通过节内注射输注到病人体内。

②鼻内给药也有类似的作用，这种给药方式会通过 DC 快速摄取抗原。上呼吸道（鼻、鼻道、鼻窦、喉和咽）含有大量的黏膜组织，黏膜组织是抵御病原体入侵的第一道防线（物理屏障）。而第二道防线则由免疫细胞组成，尤其是树突状细胞，它们在鼻上皮细胞内形成分布广泛的网络屏障（免疫屏障）。DC 能够打开呼吸道上皮细胞间的紧密连接，进而能够接触上皮以外的抗原。由于鼻内给药有非侵入性、易于给药的性质，因此这种递送方式可能很有前景。

③在人体皮肤中，也存在着许多 APC，例如表皮中的Langerhans细胞以及真皮中的间质 DC。因此，在皮内注射给药后，mRNA 会在注射部位被皮肤中的许多 APC吸收并进行局部表达，但大部分的mRNA还是被非免疫细胞例如肌肉细胞、成纤维细胞和角质形成细胞等吸收并表达（但APC可以提呈有非免疫细胞表达后分泌出的抗原）。

④骨骼肌中虽然仅存在少量的免疫细胞，但循环免疫细胞最终会经过肌肉内的给药部位，这样就会可以对肌肉细胞表达出的的抗原进行处理和呈递。不过这种局部的先天免疫反应和炎症反应的程度会影响适应性免疫。因此，传统疫苗会含有加重注射部位炎症反应的佐剂，从而促进机体在注射部位对免疫细胞进行募集和激活。

⑤还有一些研究对瘤内注射进行了评估。大家发现，肿瘤内免疫细胞的组成非常重要。一些 “热”肿瘤的特点是免疫细胞的高度浸润，该类病人有着更高的治疗疗效和和更高的生存率。因此，瘤内浸润的免疫细胞的数量和种类比例在很大程度上决定了免疫疗法的功效。目前也有一些研究测试了改变肿瘤内免疫微环境，将“冷”肿瘤转换为“温”肿瘤的方法，例如将编码免疫刺激蛋白的 mRNA和流感疫苗进行瘤内注射等，都取得了一些好的结果。

⑥最后，mRNA疫苗也可以考虑采用静脉注射，但必须克服一些风险和障碍。例如静脉注射后 mRNA 疫苗会与血清蛋白聚集也更容易被降解，LNP包裹的RNA疫苗会大量聚集在肝脏部位等，这都会对疫苗的功效造成困扰。静脉内注射mRNA疫苗最终希望得到的结果是，吞噬外源 mRNA 的免疫细胞继续游走直至到达淋巴结，然后在淋巴结中诱导和激活免疫反应。

mRNA 注射的不同位置后所诱导的免疫反应

三．基于mRNA的癌症疫苗

目前癌症疫苗主要有四种类型，包括基于肿瘤或免疫细胞的疫苗（注：基于肿瘤细胞的疫苗是指将经过修饰的死亡肿瘤细胞/注射到患者的体内，再经由DC处理肿瘤细胞表面抗原并呈递给称为 T 细胞。这些T细胞活化后可以靶向疫苗细胞系呈递的抗原，进而破坏体内表达了这些表面抗原的活的癌细胞。）、基于肽的疫苗、基于病毒载体的疫苗和基于核酸的疫苗。基于核酸（DNA 或 RNA）的疫苗是一种很有前途的疫苗平台。① 首先，核酸疫苗允许同时递送多种抗原，涵盖各种肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigens ，TAA ）和肿瘤特异性抗原（Tumor-Specific Antigens，TSA）引发体液和细胞介导的免疫反应，增加克服疫苗耐药性的可能性（注：TSA是仅在癌细胞上发现的肿瘤特异性抗原 ，不在健康细胞上表达；TAA在肿瘤细胞上高水平表达，但在健康细胞上又有一定水平的表达）。②其次，与肽疫苗不同，核酸疫苗可以编码全长的肿瘤抗原，允许 APC 进行同时呈递或交叉呈递，有可能刺激更广泛的 T 细胞反应 。③ 最终，核酸疫苗是非传染性的，在生产过程中没有蛋白质或病毒衍生的污染，因此被认为在预防和治疗应用中都具有良好的耐受性。另外作为癌症疫苗策略，mRNA 优于 DNA 的优势包括：①mRNA 可以在分裂和非分裂细胞中翻译，其中 RNA 只需内化到细胞质中，然后一步翻译成抗原，并且mRNA 蛋白表达的速率和表达量通常高于 DNA 疫苗；②与DNA疫苗不同，mRNA疫苗不能整合到基因组序列中，因此没有引起插入诱变的风险。

到目前为止，已有超过 20 种基于 mRNA 的免疫疗法进入临床试验，并在实体瘤的治疗中取得了一些有意义的结果。其中，将 mRNA 转染到 DC 后，再把该DC细胞进行过继性细胞输注 (Adoptive cell transfer)回患者体内的方法，是第一个进入临床试验的基于 mRNA 的治疗性癌症疫苗所采用的策略，并且在临床试验中，基于 DC 的 mRNA 疫苗治疗仍然占 mRNA 癌症疫苗的大多数。但与此同时，CureVac、BioNTech 和 Moderna等公司也在积极探索由非病毒载体提供的基于 IVT mRNA 的免疫疗法。例如有的研究是利用mRNA编码TAA的混合物或者个性化的肿瘤新抗原，也有的研究利用mRNA编码免疫刺激剂（例如 IL-12、IL32、OX40L、CD40L、CD70 等），通过瘤内或结内注射来改变肿瘤微环境。随着癌症免疫疗法的最新进展，特别是新抗原的发现、个性化疫苗和检查点阻断调节剂的开发， mRNA 疫苗对抗癌症的有了越来越强的可行性。

肿瘤的治疗性疫苗

1. 编码肿瘤相关抗原的直接注射mRNA疫苗

开发有效癌症疫苗的主要障碍之一，就是抗原选择困难。癌症疫苗可以以在肿瘤细胞中优先表达的 TAA为靶向（例如，酪氨酸酶、gp100、MAGE-A3、MAGE-C2 已被确定为黑色素瘤的 TAA）。在多项临床研究中，编码TAA 的 mRNA 疫苗混合物已用于治疗转移性黑色素瘤。

在早期的研究中，科研人员会直接注射无包裹的裸mRNA到体内。有研究显示，经皮内或淋巴结内给药的裸mRNA可以在小鼠或人体中引发T细胞反应。结内注射的基本原理是将疫苗直接输送到 T 细胞启动区域，以供常驻 DC 吸收。未成熟的 DC 在淋巴结和真皮中对裸露 mRNA进行摄取的主要机制是巨胞饮作用。mRNA在DC细胞内表达TAA，再由MHC呈递给T细胞。裸 mRNA 疫苗的可行性和安全性首先在 15 名转移性黑色素瘤患者的 I/II 期试验中得到证实，该试验使用皮内注射自体肿瘤 mRNA 和 GM-CSF（注：① 该mRNA所编码的肿瘤相关抗原包括粘蛋白 1 (MUC1)、癌胚 (CEA)、人表皮生长因子受体 2 (Her-2/neu)、端粒酶、存活素、和黑色素瘤相关抗原 1(MAGE-A1)；② 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF，又名集落刺激因子2 colony-stimulating factor 2，CSF2，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的一种单体糖蛋白细胞因子。GM-CSF可促进DC细胞及巨噬细胞等抗原呈递细胞的增殖与分化，可以有效诱导多种具有抑瘤效应的免疫细胞增殖，从而发挥抗肿瘤免疫反应。GM-CSF治疗在肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、黑色素瘤及恶性血液病中具有显著的抗肿瘤和免疫调节作用。虽然GM-CSF可以有效提高患者体内抗原呈递细胞的活性与增殖水平，但是激活机体自身抗肿瘤免疫反应仍需要体内有大量肿瘤抗原释放才能被抗原呈递细胞识别并结合，从而呈递给T细胞）。疫苗接种具有良好的耐受性，没有严重的副作用和诱导临床反应。几乎所有具有临床反应或疾病稳定的受试患者都检测到了免疫反应，患者接种疫苗后引发的 T 细胞反应在治疗期间可以持续数月，并且这种方法可以产生针对多种抗原的多克隆免疫反应。但在这项试验中，临床有效性并不明显。

肿瘤的TSA与TAA

局部给药的一个主要限制是只有经过注射给药的淋巴结才能进参与抗原特异性 T 细胞启动。静脉内mRNA给药则需要一些载体制剂将 mRNA 递送至全身二级淋巴器官，其中包括作为免疫细胞最大聚集体的脾脏。静脉给药时所选用载体需要可以保护 RNA 的完整性，还需要可以促进RNA在淋巴结驻留 DC 中的靶向表达。通常的载体制剂包含聚合物，如鱼精蛋白，或纳米脂质体等等。例如已经开展临床试验的BioNTech的BNT111，它是使用lipoplex脂质体纳米颗粒包裹着编码了四种黑色素瘤抗原（分别是NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和 TPTE）的mRNA，再用静脉注射的方式给到患者体内。该脂质体纳米颗粒的特性可以将mRNA 有效地递送到脾脏的 DC中，并导致 NK 、 B、CD4 +、CD8 + T 细胞的强烈激活。在目前的临床试验中，BNT111单独或与检查点抑制剂 PD1 的阻断联合使用，治疗接受检查点抑制剂 (CPI) 治疗的不可切除黑色素瘤患者。目前已经在受试者体内观察到高强度的、针对疫苗抗原的CD4 +和 CD8 +的T 细胞免疫反应。一些受试者的抗原特异性细胞毒性 T 细胞反应的量级甚至与过继性 T 细胞治疗的常见量级相当，并且时间持久。

BioNTech 与 Moderna的癌症疫苗研究管线

2. 编码肿瘤新抗原的直接注射mRNA疫苗

就目前来说，有些障碍限制了 TAA 疫苗的进一步应用，这其中包括：①对于某些实体瘤，仅鉴定出有限的 TAA，导致其应用受到了限制；②患者的 TAA 具有广泛的变异性，导致可以逃避免疫效应物的识别；③TAA也存在于正常组织中，因此针对 TAA 的疫苗可能会引发中枢和外周耐受反应，从而降低疫苗接种效率或者产生针对正常组织的自身免疫。肿瘤特异性抗原，也被称为新抗原，它们来源于肿瘤细胞中的随机体细胞突变，因此而不存在于正常细胞中。与那些未突变的自身TAA抗原相比，新抗原可以被宿主免疫系统识别为“非自身”的motif，因此是目前癌症疫苗的一个有吸引力的靶标。

很多实验已经证实，新抗原具有免疫原性，可以导致 T 细胞反应。并且许多临床前和临床研究表明，新抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 是最有效的肿瘤排斥 T 细胞之一。然而，患者体内天然存在的新抗原特异性 CTL 的情况却通常很少见，这可能是由于新抗原在肿瘤细胞群体中克隆频率低和新抗原的提成效率较低造成的。因此，通过癌症疫苗来增强机体针对新抗原的有效免疫，进而利用免疫系统来杀伤肿瘤细胞是可行的。

编码肿瘤新抗原mRNA疫苗是一种真正的个性化疫苗，因为大多数新抗原来源于每个肿瘤基因组中的独特突变。因此，识别患者特异性的具有免疫原性的新抗原是开发此类个性化疫苗的第一步。随着基因组测序技术以及 MHC 表位数据库和预测算法的进步，现在可以识别和筛选个体患者的癌症新抗原。通常，会先对患者肿瘤或肿瘤相关样本进行全外显子组或转录组测序 ，进而通过比较肿瘤和健康组织的序列来识别肿瘤癌细胞中的非同义体细胞突变，例如点突变和插入缺失。接下来，再使用 MHC 肽结合亲和力的预测算法，对所发现的突变进行筛选，以确定可以用于制造个性化癌症疫苗的最具免疫原性的抗原（这个筛选要考虑蛋白酶体对该肽的加工、与MHC的亲和力等等，目前的算法多是针对于识别 MHC I 类分子，针对于MHC II类分子的算法则少得多）。

基于MHC I 类分子的抗原提呈预测工具

目前有多项研究编码新抗原的 mRNA 疫苗的安全性和有效性的临床试验正在进行中。例如Moderna开发的 mRNA-5671，它是用脂质纳米颗粒 (LNP) 包裹的mRNA 癌症疫苗，编码了四种最常见的 KRAS 突变（G12D、G12V、G13D 和 G12C）的多肽序列，具有潜在的免疫刺激和抗肿瘤活性。在接种疫苗后，mRNA 生成的 KRAS 靶向肽被抗原呈递细胞 (APC) 吸收和翻译。翻译后，抗原通过 APC 表面上的主要组织相容性复合体 (MHC) 分子呈现给免疫系统。这导致细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和记忆 T 细胞依赖性免疫反应的诱导，这些免疫反应特异性靶向和破坏具有这些特定 KRAS 突变的肿瘤细胞。

新抗原发现、疫苗制造和配制以及患者接种疫苗过程

3. 基于mRNA的DC疫苗

DC是专业的抗原呈递细胞，它会不断吞噬周围环境中的细胞物质再将其处理后传递给免疫系统。为了有效地将肿瘤抗原递送至 DC，许多早期研究致力于对离体的 DC进行改造或抗原转染，再通过皮下、结内或静脉注射将转染细胞重新输注给患者。DC 疫苗的生产需要从自血液中分离单核细胞或造血祖细胞开始，再经由离体培养、分化和肿瘤抗原加载等步骤完成DC疫苗制备，成本高且工艺复杂。目前常见的策略包括：①使用确定的 TAA/TSA等的 mRNA来转染DC ，但似乎被转染了mRNA 的 DC 疫苗诱导的 T 细胞反应比较微弱，这可能是抗原负载影响了DC 分化、成熟、归巢和 T 细胞共刺激以至于有的临床疗效较低 ；②工程优化DC 的抗原呈递。同源的辅助T细胞的协助，是决定疫苗激活CLT细胞反应的关键因素（因此需要强化DC的抗原交叉呈递能力），这就需要DC也能够把疫苗抗原呈递在MHC II 类分子上。转染到 DC 中的 mRNA 在细胞质内进行翻译，翻译后的蛋白会进入内源性抗原加工区-蛋白酶体中，进而呈现在 MHC I 类而不是 MHC II 类分子上（虽然DC也可以进行交叉呈递）。目前有几种方法能够促进在DC上的交叉呈递，例如可以将mRNA编码的抗原靶向到溶酶体区室，从而增强 MHC II 类分子介导的抗原呈递（将疫苗抗原与溶酶体相关膜蛋白相融合，或与MHC I 类分子的跨膜结构域相融合等等）；③在DC内表达共刺激配体或共刺激细胞因子等，正如前文提到的，为了激活T细胞反应，除了抗原识别信号外（相当于TCR 与肽-MHC 复合物的结合），还需要有共刺激信号，以及随后连续产生的细胞因子来辅助。因此这个策略旨在通过将抗原与免疫刺激配体、共刺激细胞因子一同表达，以增强 DC 成熟和 T 细胞共刺激，从而进一步提高载有肿瘤抗原的 DC 疫苗的 T 细胞启动能力。

基于mRNA的DC疫苗

总之，mRNA 是一个功能强大且用途广泛的癌症疫苗平台。小编的这个文章也只是把几篇重要的综述简单化，然后把最入门的内容翻过来推给大家。那小编也把所有的参考文献放在了附录中，以供大家对感兴趣的内容进行深究。

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