简述生物人工肝中的肝细胞来源
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这其中就包括上海微知卓生物科技有限公司（微知卓）自主研发、全球创新的生物人工肝产品～血浆生物净化柱的IND，在中国用于治疗乙型病毒性肝炎等引起的慢加急性肝衰竭，这标志着我国首个生物人工肝产品即将进入国内注册临床试验阶段。据悉，这也是目前国际上唯一进入临床阶段的生物人工肝产品。作为这一项目的亲历者和见证者，宜明细胞为微知卓生物提供了合规、高效、高质量的药物工艺开发及生产CDMO服务，涵盖了菌种库构建、临床级质粒、慢病毒制备及检测等服务，助力微知卓加速推动该项目的临床化进程，为急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）患者提供了颇有潜力的治疗选择。
急性肝衰竭是病毒性肝炎一种危重的临床综合征，传统支持性治疗后的病死率仍高达80%～85%，严重暴发性肝衰竭死亡率更高达90%。目前，肝移植是ALF最有效治疗措施，然而供肝短缺，仅有不到10%的患者有肝脏移植的机会。
为了帮助患者实现肝移植或促进肝功能的自发恢复，人们开发出体外人工肝支持系统。人工肝支持系统主要分为非生物人工肝和生物人工肝。非生物人工肝系统就像一台小型透析机，通过血浆交换、血液滤过、血液透析和血液灌流等方法来清除血液或血浆中的代谢废物和毒素，这一系统虽然应用方便，但不能合成生物转化肝脏特异性蛋白和凝血因子，不能显著提高ALF患者的生存率。而生物人工肝（bioartificial liver，BALs）中则可以通过生物反应器培养功能性肝细胞以提供类似肝脏的各种功能，如解毒、凝血功能障碍矫正、抑制炎症和促进肝细胞再生等，BAL是目前延长急性肝衰竭患者生存时间最有希望的替代方法。
BAL的基本原理（见图1）是将患者血浆通过体外循环与生物反应器中的人肝细胞进行物质交换，短时间替代肝脏工作。具体来说，氧气和营养物质通过细胞膜从血浆扩散到肝细胞，以维持细胞活性；同时血浆毒素也转移到肝细胞并转化为无毒的代谢物，这些代谢物与合成物质(如白蛋白、纤维蛋白原、凝血因子等)再返回血浆。因此，BAL治疗可以维持ALF病人的内稳态，并使肝脏从严重损伤中恢复，是一种极有潜力的治疗方法。
图1. BAL的工作原理示意图[1]
BAL支持系统主要由功能肝细胞、细胞生物反应器和循环透析辅助装置组成。其中肝细胞是BLA的核心要素之一，反应器中肝细胞功能的好坏直接关系到生物人工肝的治疗效果。本文将介绍BAL的不同来源的肝细胞以及各自的利弊。
理想的BALs细胞源具有以下特点：容易获得、成本低、体外扩增迅速、人源性、生物安全性以及优良的生物功能。迄今为止，BALs主要有以下6种细胞来源（见图2）。
1. 动物源性肝细胞
以猪肝细胞常见，具有与人肝细胞相似的功能。易获得，成本低。从猪肝中分离出的肝细胞数量通常超过109，可以BAL系统的应用需求。然而，猪肝细胞表型不稳定，只能短期应用。此外，猪肝细胞存在免疫反应和疾病传播的潜在风险，无法保证其生物安全性。
2. 肿瘤源性肝细胞
最常用的肿瘤源性肝细胞株包括HepG2, C3A, 以及HepaRG 。这类细胞具有在体外无限增殖的优势，虽然这一优势可以满足BAL对细胞增殖密度的要求，但是也会导致细胞肝功能的损失。另外应用肿瘤源性肝细胞的BALs在临床治疗过程中还存在细胞泄漏的风险 ，有可能会诱发患者体内的肿瘤发生。因此，肿瘤源性肝细胞在BALs中的应用非常有限，如何增强生物学功能并解决安全性问题是应用这类细胞的首要问题。
3. 永生化肝细胞
细胞永生化的基本原理是将永生化基因（如SV40LT）引入原代细胞，或者过表达端粒逆转录酶，从而开发出永生化肝细胞。为了避免SV40LT的致癌风险，人们使用Cre-loxP酶特异性重组敲除可逆永生化肝细胞的靶向sv40LT基因。永生化肝细胞系作为新的种子细胞具有极强的尿素生成与氨清除能力，可以显著减轻肝性脑病症状和体征。但永生化细胞表型、核型往往不稳定，需优化载体，其肿瘤抗原也不能完全清除。因此，在临床应用于BALs前，必须进一步降低永生化肝细胞的安全风险。
4. 原代人肝细胞(PHHs)
PHH被认为是BALs的最佳细胞来源。然而，PHHs的数量非常有限，一是由于供体器官的短缺，二是PHH无法在体外大规模扩增，因此难以满足BAL应用。此外，脆弱的原代细胞在长期体外培养中容易失去其原有的生物学功能。
近年来，多个研究小组在这一领域都取得了突破。2018年惠利健团队不仅实现了PHHs的大规模扩增，且增殖的人肝细胞具有肝细胞和肝祖细胞的特征，在类器官培养中可恢复到成熟表型，并能显著高效地在小鼠肝脏中再生。此外，Hans Clevers 小组证明3D类器官培养是一种长期培养原代肝细胞的有效方法。通过长期3D类器官培养可以实现原代肝细胞的增殖，并在成功移植到动物模型后，可以重现肝脏在急性损伤时的再生行为。
5. 干细胞衍生肝细胞
干细胞，如人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hiPSCs)，都可诱导分化为成熟的肝细胞。从hiPSCs衍生的肝细胞表现出与原代肝细胞相似的肝特异性功能。由于规避了hESCs的伦理和政策问题，hiPSCs成为了生成功能性肝细胞的热点。另外iPSC衍生肝细胞可以去除基因整合以及背景致癌基因的表达，使之成为一种安全而且又颇有前景的BAL肝细胞源。
有研究小组使用了一种优化的分化方案，并采用了一种有效的两步扩增培养系统，从hiPSCs中衍生出大量功能性肝球状体。将约1 × 109个hiPSC来源的肝球状体组装成多层BAL装置，成功拯救了ALF猪。另一个研究小组开发了一种新型的仿生BAL系统，该系统在中空纤维生物反应器中加入装载hiPSC衍生肝细胞的微载体，对于ALF兔有很好的疗效。然而，开发稳定有效的hiPSC分化方案和培养方案成本高、时间长、劳动强度大。临床治疗的BAL系统若应用hiPSC衍生的肝细胞还需要不断地优化。
6. 直接重新编程肝细胞
功能性肝细胞也可以通过直接谱系重编程产生。惠利健团队与Atsushi Suzuki小组首次报道了小鼠成纤维细胞转化成肝细胞的方法，该方法可以加速肝细胞的产生，并绕过复杂的hiPSC分化过程。2011年，惠利健团队通过转导Gata4、Hnf1α和Foxa3并使p19Arf失活，直接从小鼠尾尖纤维母细胞诱导出功能性肝细胞样细胞。这一研究成果获评“2011年度中国十大科学进展”。2014年该团队又通过慢病毒表达FOXA3、HNF1A和HNF4A， 又成功将人成纤维细胞转分化为功能肝细胞（hiHep细胞）。幸运的是，hiHeps具有高度的可扩展性，可表达肝脏基因谱，并具备成熟肝细胞的典型生物学功能。鉴于hiHep类器官具有典型的肝脏特异性结构和功能。惠利健等在BAL装置中进行了hiHeps的大规模培养。hiHep-BAL治疗恢复了ALF猪的肝功能，修正了血氧和胆红素水平，延长了猪的生存期。该hiHep-BAL系统已成功治愈了多例ALF患者，具有良好的安全性和有效性。为了让更多患者受益，2017年微知卓获得惠利健团队的这项细胞转化技术的全球独家使用许可授权，并成功地将这一技术推进到临床试验阶段。2022年11月1日，微知卓自主研发的生物人工肝产品的IND申请已获CDE批准，这是世界上首例进入临床试验阶段的生物人工肝产品。
综上所述，要获得理想的BALs细胞源道阻且长。动物源性肝细胞存在异种动物性感染以及免疫应答的风险，极大地阻碍了这一系统的临床进展。高增殖的肿瘤源性肝细胞可满足临床治疗所需的细胞数量，但细胞存在肝功能的缺陷。相反，PHH具有良好的肝功能，但很难获得。永生化肝细胞虽具有持续增殖能力，又有潜在的致瘤性 。而hiPSC衍生肝细胞虽然可以作为BAL的肝细胞源，但其复杂分化的过程使之成本高昂且耗时。最后，直接将人成纤维细胞重编程为肝细胞，即可以快速生成功能性hiHeps，又具备可扩展性，近来微知卓人工肝产品的IND获批，也证明这一肝细胞源是颇具前景的选择。
我国是“肝病大国”，晚期肝衰竭患者约有45万人，在人口老龄化加速的大背景下，晚期肝衰竭患者数量会持续攀升；另外，未来人工肝治疗还将向早中期肝衰竭患者普及（我国肝衰竭早中期患者超过百万人），人工肝治疗市场容量将会不断扩增，而满足这一医疗需求未满足领域的根本还是取决于生物技术的不断创新与进步，同时借助CDMO企业的技术东风，让好药新药尽快尽早惠及广大患者。（作者：Dr.Yang 宜明细胞）
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1.https://doi.org/10.3390/biomimetics6040062
2.https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac6e86
3.https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.01.003
4.www.technologynetworks.com
5.doi:10.1038/nature10116
6.doi:10.1038/cr.2016.6
7.https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.10.018
8.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2019.01.001
9.DOI：10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2016.02.001.
10.https://mp.weixin.qq.com/s/PHeZQTJrsQ1yqYS0w-phNA
11.https://mp.weixin.qq.com/s/FkL8PnnoPXV1K2iBHYjwIA
E.N.D
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