先导编辑器（Prime Editing）研究进展

先导编辑器（Prime Editing）是2019年David Liu 课题组开发的第三代基因编辑技术，它可以在不需要双链 DNA 断裂的情况下，实现基因组DNA特定碱基的替换、插入和删除^[1]。与其他CRISPR-Cas衍生的基因组编辑工具（包括CRISPR核酸酶和碱基编辑器）相比性，先导编辑器具有编辑范围更广、脱靶效应更低等优点，因此在人类罕见病治疗等领域有更广阔的应用前景。本文将首先对先导编辑器工作原理做简要介绍，梳理其近年来重要的研究进展，并介绍其在疾病治疗等领域的相关应用。

先导编辑器包含 Cas9-H840A 切口酶 (nCas9)与逆转录酶 (RT)形成的融合蛋白以及所需编辑序列的 pegRNA。pegRNA 由三部分组成：(1) 20 个核苷酸 (nt) 的间隔区序列，与sgRNA功能类似，其将引导 Cas9-H840A 切割含有 PAM 的目的片段，形成活动的单链 DNA (ssDNA)。(2) 引物结合位点 (PBS)，作为 RT 的引物； (3) RT 模板 (RTT)，其中包含目标编辑序列。当 pegRNA 中的间隔区序列与 DNA 结合时，Cas9n 将切割DNA 的非互补链PAM 上游的第三个碱基，产生 ssDNA。然后 PBS 将与ssDNA结合并作为 RT 的引物，RT 将包含所需编辑的核苷酸整合到 ssDNA中（图一）。在逆转录过程之后，带切口的双链 DNA 将在经过编辑的 3' ssDNA和未编辑的 5' ssDNA之间进行平衡。5' 核酸内切酶（例如 FEN1）或 5' 核酸外切酶（例如 EXO1）会对未经编辑的 5' ssDNA进行切割，最终导致所需的 DNA 编辑产物^[1]。为提高目的碱基的编辑效率，David Liu组利用一个简单的sgRNA在未编辑的互补链中创建第二个缺口。通过内源性DNA错配修复系统，将被编辑的DNA链作为模板，刺激未编辑的DNA链的再合成。先导编辑器设计之初，可实现12种碱基的任意替换，以及多达44个碱基的插入对和多达80个碱基对的删除，原则上可矫正89%的人遗传病；但对于大序列的替换或缺失(即>100bp)，先导编辑器效率极低^[1]。另外，与碱基编辑器（如ABE和CEB）相比, 先导编辑器的编辑效率依然偏低。针对上述两个问题，目前已有多个课题组试图寻找解决方案。

图一、先导编辑器工作原理^[2]

为拓展先导编辑器的编辑范围，David Liu和殷昊等课题组通过双pegRNA策略，这两个pegRNA可相互互补，或分别可与内源DNA互补，因此利用该方法可以将原本位于两条pegRNA切割位点中间的大段DNA删除（~10kb），或可在这之间插入1kb左右的DNA片段（图二）^{[3, 4]}。另外，利用相似的原理，姚少华等课题组，实现了染色体片段的异位颠换^[5]。为提高先导编辑器的编辑效率，David Liu 课题组利用CRISPR大规模筛选技术，发现DNA的错配修复系统会显著抑制先导编辑的编辑活性，并基于此开发了包含MLH1dn蛋白的新型先导编辑器，由于MLH1dn可抑制错配修复，该编辑器大大提高了编辑效率^[6]。另外，通过对先导编辑器内逆转录酶结构及氨基酸序列优化，开发出的PEmax同样可提高编辑效率^[6]。除了对先导编辑器内的蛋白组成及序列优化外，研究人员还通过对pegRNA 3’端引入保护结构如evopreQ1和xrRNA，或对pegRNA结构优化（如pegRNA环化）等方式，提高pegRNA在体内的稳定性，防止其被核酸酶降解^[7-9]。另外，陈佳等课题组发现在pegRNA的逆转录模板（RTT）中规律性的引入同义突变, 可将目的碱基位点的转换效率平均提高353倍 （最高至4976倍）^[10]。

图二、双pegRNA编辑原理^[3]

丝氨酸重组酶作为一种DNA整合酶，发现于噬菌体DNA整合到细菌基因组DNA过程中，丝氨酸重组酶（如Bxb1和PhiC31等）可结合大片段DNA并催化其整合到基因组中，该过程依赖分别依赖于供体DNA的attP元件以及受体基因组中存在的attB元件（图三）。因此丝氨酸重组酶不便将DNA插入到除其特定目标序列之外的任何位置^[11]。

图三、丝氨酸重组酶工作原理^[12]

2021-2022年David Liu和Abudayyeh-Gootenberg课题组，先后通过联用先导编辑器和丝氨酸重组酶的方式（分别称为twinPE和PASTE技术），实现了大片段DNA（最高达3万碱基对）的定点插入^{[3, 13]}。该过程首先利用先导编辑器在目标基因位点插入attB序列，然后转染含有attP序列的所需插入片段，之后在丝氨酸重组酶的帮助下将目标DNA大片段插入到基因组特定位置。由于丝氨酸重组酶如Bxb1和PhiC31，在人源细胞的活性较低，因此上述方法介导的超大DNA片段插入活性扔有待提高。2022年Patrick Hsu等利用通过计算机识别和实验验证等方法，发现了一系列活性较高的丝氨酸重组酶,，新型丝氨酸重组酶的质粒重组效率与此前常用的Bxb1相比要高7倍，其人基因组插入效率为40%-75%，插入的DNA片段大小超过7kb^[14]。因此，通过与新型丝氨酸重组酶联用，先导编辑器可能在由于大片段删除导致的罕见病（如亨廷顿氏病）治疗中发挥重要作用。

先导编辑器的一个基本应用是通过在细胞系中引入点突变、缺失和插入来研究基因功能。这之前是通过基于HDR的方法或基于双sgRNA的靶向缺失方法实现的。此外，先导编辑器可通过设计在pegRNA中 PBS和RTT的同源臂之间包含的随机序列，从而在目标位点整合多达10 bp的随机序列。这一名为Random-PE的技术在PAM文库构建、增强子筛选和DNA标记等方面显示出前景^[15]。此外，先导编辑器饱和诱变可用于实验分析给定内源性基因中数百种变异体的致病性。例如，为了研究BRCA2变异体对细胞增殖的影响，将含有426种不同BRCA2变异体的pegRNA文库转染到BRCA2单倍体化的HEK293T细胞中，并在转染后6天和14天对细胞群进行收集。然后通过计算在两个时间点之间每个pegRNA读取计数的对数变化倍数来反应该基因突变的功能性或致病性^[16]。先导编辑器还可用于建立人类不同疾病的动物模型或研究体内基因改变的病理功能。当然先导编辑器最重要的应用潜力便是疾病治疗，目前已有多个课题组利用构建的家族性高胆固醇血症、苯丙酮尿症和先天性黑朦症等小鼠模型，通过对肝脏和眼部特异性递送先导编辑器，纠正致病基因，从而改善上述遗传病表型。

由于pegRNA特殊的序列及结构，先导编辑器所产生的sgRNA依赖的脱靶效率低于碱基编辑器，另外与碱基编辑器相比，经先导编辑器编辑后并未测到sgRNA非依赖的的全转录组脱靶突变，因此先导编辑器的特异性较高^[17]。但用于先导编辑的pegRNA序列较长，设计复杂，编辑效率预测困难。2020年Hyongbum Henry Kim课题组通过54,836条pegRNA对其靶标序列编辑效率的大规模分析发现Cas9活性、GC含量、Tm值等影响先导编辑活性的因素，并开发在线工具http://deepcrispr.info/DeepPE 来预测pegRNA效果，该研究对大大提高了pegRNA设计的可靠性^[18]。另外，为解决pegRNA手动设计困难，多个课题组相继开发了Easy-Prime,、pegIT、 PrimeDesign和PnB Designer等软件^[19-22]，简化了pegRNA设计流程及准确性。

虽然与胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器相比（它们的正确率分别为~50%和~40.87% - 64.22%）^{[23, 24]}，初始先导编辑系统效率相对较低，但通过将MLH1的显性负相关蛋白与其偶联后，编辑效率可达约40% - 50%，与碱基编辑器相当。但MLH1大小约为2.2 kb, 因此新型先导编辑器的总大小超过8.3 kb，远远超过AAV病毒的包装上限（~4.7kb）^[6]。尽管已有研究利用内含肽(intein)介导的双AAV系统递送基因编辑器^[25]，该方法可以将AAV的包装上限提高至9.4kb, 但由于新型先导编辑器表达还需启动子、BGHpA和WPRE等元件，其总大小已接近9.4kb的双AAV系统递送上限，因此将高效率的新型先导编辑器应用于临床或临床前研究尚需时间。近年来，迷你CRISPR-Cas系统的出现似乎为解决上述问题提供了解决方案。

基于先导编辑器技术的Prime Medicine 公司于2022年10月20日在纳斯达克完成上市，初上市市值约16亿美元。与目前知名的基因编辑公司如CRISPR、Intellia和Beam等初上市市值5~8亿美元相比，Prime Medicine的初上市市值明显较高，展示出外界对先导编辑器的极高期望。Prime Medicine已在肝脏、离体造血干细胞、神经肌肉系统和肺等多个器官进行临床前研究布局。另外针对大片段基因缺失，Abudayyeh-Gootenberg等基于PASTE技术，于2021年创建Tome Biosciences公司，该公司目前处于隐身状态，但披露其在2026左右有研发管线进入临床。

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参考资料：

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E.N.D

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