质粒和病毒载体生产工艺流程解析
质粒生产工艺流程包括逐级放大的菌体扩增过程和下游纯化过程,细胞与基因治疗中最常用的载体AAV和慢病毒的生产都需要质粒作为起始材料,因此每年需要大量符合质量要求的质粒来满足下游细胞与基因治疗的市场需求。
质粒生产工艺中面临的最大挑战是大规模的生产放大和纯化,既要维持高超螺旋结构质粒的比例,又要保持高纯度,以上两点无论对于DNA疫苗还是对于下游病毒生产的效率与质量 (如减少空壳率等)形成重大影响。
质粒通常在大肠杆菌中发酵扩增,提高大肠杆菌的生长密度可扩大质粒的产量。但细菌密度增加会带来溶氧不足的问题,不仅会降低质粒产量,还会导致质粒质量下降,具有超螺旋构象的质粒含量减少,给下游纯化工艺带来困难,也会间接提高生产成本。对大肠杆菌发酵过程中的溶氧量问题进行优化后,可使质粒产量提高1至50 倍。
大肠杆菌的裂解包含化学方法(碱、洗涤剂、酶、渗透冲击)和物理方法(加热、 剪切、搅拌、超声波和冻融),其中碱性裂解是最常用的方法。碱裂解步骤中,pH 的控制和适当有效的混合是关键,需要在狭窄的pH范围内使基因组DNA发生不可逆变性且质粒双链需要保持完整,大规模质粒生产中,裂解过程往往工艺重复性差, 难以控制;该阶段的质粒对剪切力非常敏感,质粒损失较大,超螺旋也容易丢失, 影响产量和质量。
质粒生产过程中常用层析法或色谱法进行纯化,不同开发阶段和使用级别对质粒的质量要求不同。质粒纯化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和内毒素以及非超螺旋的质粒变体,以满足针对目标产品的使用要求,纯化过程的优化可提高质粒产量、降低成本。质粒作为细胞与基因治疗药品的生产原料,需要对其理化性质进行鉴别,确保目的基因序列及整合无误;作为关键原材料或终产品,需要对其功能进行鉴定和控制;为保证安全性,对内毒素、杂菌污染和支原体残留的鉴别和检测的周期往往约30天左右,决定着质粒生产批次放行的周期;此外,质粒因为无法终端灭菌,因此需要全程在封闭且独立的生产车间进行,且要避免交叉污染,因此自动化、封闭式的系统是未来趋势。
当使用高拷贝数质粒、采用优化的发酵工艺可获得约1-2g/L的质粒,但目前行业内绝大部分公司的质粒产量不到0.5g/L,工艺优化的空间还非常广阔。质粒由于结构简单,且理化性质相似,因此构建一个平台化的生产和纯化工艺相对简单。质粒生产周期较短,上游发酵和下游纯化罐装工艺约需6天,但质粒的质量控制约需30天(主要对支原体等检测周期较长),质粒生产的年产能可达100批次。
综上,质粒生产的工艺优化对于提升质粒的产量和质量具有极大的意义,在大肠杆菌大规模发酵、质粒的提取和纯化工艺上,目前仍然具有非常广阔的优化空间。
AAV生产成本其关键在于质粒和细胞培养体系HEK293细胞/三质粒系统是AAV生产的主流系统:AAV生产系统包括HEK293细胞/三质粒系统和依赖于昆虫杆状病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒或痘病毒的包装系统。以HEK293细胞/三质粒系统和昆虫杆状病毒系统最为常见,但由于昆虫杆状病毒系统的单个细胞生产效率低、病毒活性低等特点,目前业内最主流的还是采用HEK293 细胞/三质粒生产系统。AAV载体生产成本的控制较为关键。据Nature Reviews Drug Discovery披露,目前约有238个基于AAV的细胞与基因治疗临床试验正在开展,是临床试验中使用最多的病毒载体之一。AAV细胞与基因治疗产品价格高昂的主要原因在于其工业化生产的多个方面未得到全面优化,如何降低成本、扩大商业化生产能力是AAV基因治疗产业化的最大难题。我们以AAV的生产工艺过程为基础,分析AAV载体生产过程中的成本控制关键。质粒是AAV生产成本的主要来源:根据Polyplus公司披露,AAV载体生产过程中, 质粒约占了生产成本的40-60%,除此以外,细胞和培养基以及血清约占生产成本的 20-30%。质粒价格约为10-30万美元/g,质粒用量大约为1μg/106个细胞。对于病毒载体生产,每升生物反应器大约平均需要0.5mg质粒DNA进行瞬时转染细胞,各厂家依据所用转染试剂的不同,每升生物反应器的质粒需求量也有所差异。因此优化的质粒生产工艺(提升产率与质量)和减少下游质粒的使用量(如开发效率高的转 染试剂)能大幅降低AAV载体生产成本。
慢病毒载体其纯化生产工艺中的最大瓶颈慢病毒载体能整合进宿主细胞基因组和不具有组织特异性的特点,使慢病毒载体被广泛用于体外细胞基因治疗中。CAR-T、UCAR-T、CAR-NK和干细胞产品主要使用慢病毒载体。目前常用的第三代慢病毒载体系统由四质粒构成,其中三个质粒为标准化的质粒,另一个包含目的基因的载体质粒为个性化的质粒,同AAV一样,质粒也是慢病毒载体生产的一个重要成本来源。第三代载体系统增加了两个安全特性, 一是构建自失活的慢病毒载体,二是用异源启动子序列代替Tat基因,更加安全。悬浮无血清培养逐渐替代贴壁培养体系:慢病毒的悬浮无血清培养已逐步替代传统的贴壁培养模式,慢病毒贴壁培养的制备需要使用大量进口血清,而这些进口血清价格高昂,是成本中不可忽略的因素,慢病毒悬浮无血清培养可以极大地降低生产成本。另外,贴壁培养中,Cell stack替代细胞工厂也是一个趋势。慢病毒载体理化性质不稳定,活性易丧失,回收率低,下游纯化工艺是关键:慢病毒载体的上游工艺难以产生差异化,最大的挑战在于慢病毒载体的纯化过程。慢病毒载体由于具有包膜结构,理化性质不稳定,对剪切力敏感,因此下游工艺中的回收率较低,通常只有10%左右,优化后的回收率大概为30-40%,滴度大约为106 -108TU/mL,因此对下游纯化工艺的开发和优化是慢病毒规模化生产的瓶颈和关键。慢病毒载体生产成本测算:根据 Ruxandra-Maria Comisel 等 在 Biochemical Engineering Journal中对五种不同细胞培养体系下慢病毒载体的生产成本(GOG) 进行了测算(基于模型假设),并且基于此对慢病毒载体的生产成本进行拆分,细胞培养体系为10层细胞工厂(CF10)、中空纤维生物反应器(HF)、固定床生物反应器(FB)、微载体摇摆式生物反应器(RMmc)和悬浮培养下的一次性搅拌槽式生物反应器(SUB(STR))。不同培养体系下成本测算:SUB、RM和FB可获得最大程度的规模效应,随着规模放大到生产10,000剂量,每剂量的慢病毒生产成本可低至1200美金;CF10和HF难以实现规模化效应,每剂量的生产成本分别约38000美金和9300美金。因此,悬浮培养、固定床生物反应器和微载体对于规模化生产慢病毒载体最为经济,可有效降低生产成本。
逆转录病毒载体生产技术门槛高,成本相对更低,转染效率更高逆转录病毒载体生产技术门槛高,需要一定的技术积累,但其发展比较早,因此工艺生产相对更加完善。逆转录病毒能通过稳转细胞系进行生产,因此产品质量相比 慢病毒载体更加稳定,工艺放大容易,单个批次生产的逆转录病毒载体可供500名病人进行细胞治疗。Kite和Brammer公司均采用逆转录病毒载体技术进行基因治疗研 究,Kite的Yescarta以PG13-CD19-H3稳转细胞系为起始物料。逆转录病毒的成本更低:相比于慢病毒载体,逆转录病毒载体的成本低10倍以上。Novartis的Kymriah采用慢病毒载体进行制备,定价为47.5万美元,Kite的Yescarta 采用逆转录病毒进行制备,定价为37.3万美元,相较于Kymriah降低了约21.5%。原因在于慢病毒载体的生产需要毫克级别的质粒进行转染,而逆转录病毒载体仅需微克级别的质粒,在大规模生产上大大节约了成本。逆转录病毒的感染效率更高:逆转录病毒的感染效率高,应用于细胞治疗时相对于慢病毒来说,CAR的阳性率也更高,因此尽管逆转录病毒的生产工艺门槛高,但从长远的应用和效益来看,逆病毒载体仍然具有很大的优势。逆转录病毒的插入毒性是其临床应用发展的障碍。早期的体外细胞与基因治疗多采用γ-逆转录病毒作为递送载体,直到在治疗一项X连锁的重症联合免疫缺陷病的临床试验中,γ-逆转录病毒在9位受试者中造成了4位受试者发生了T淋巴细胞白血病的严重副反应,γ-逆转录病毒的安全性再次受到质疑,慢病毒载体的临床使用逐渐增多。尽管两种载体都能插入到基因组中,但γ-逆转录病毒载体更倾向于整合到转录起始位点附近,更容易具有致癌风险,加上逆转录病毒只能感染分裂中的细胞,制约了 其临床应用的发展。
腺病毒载体生产工艺相对成熟,成本低廉腺病毒载体被广泛用于溶瘤病毒、腺病毒载体疫苗等,重组腺病毒载体包括二型或五型,以五型最为常用。目前常用的腺病毒包装体系为AdEasy和AdMAX,均通过穿梭载体将目的基因重组到腺病毒骨架上。由于与腺病毒早期转录复制相关基因E1和E3在包装系统是缺陷的(E3基因为病毒产生非必须基因),因此腺病毒的包装需要表达E1的细胞系,生产中常用稳定表达E1基因的HEK293细胞作为腺病毒包装系统。腺病毒载体的构建技术相对更加成熟,并且可以实现大规模悬浮细胞培养,因此生产成本相对低廉。
由于腺病毒可以通过病毒毒液感染细胞的方式来扩大病毒产量,因此相比于需要使用大量pDNA的AAV、慢病毒等病毒载体的生产,其成本非常低。
来源:广发证券E.N.D
更多精彩内容,点击下方视频号往期文章推荐:
XBB新冠毒株爆炸式攻占美国:比例高达40%!已成头号毒株!
一年时间国内13款AAV基因疗法IND获批,国内AAV基因疗法加速发展
《Nature》发布2023年最值得关注科学事件,包括mRNA药物、基因编辑
新冠吸入和鼻喷疫苗的异同?为何中国能领跑全球?吸入治疗药物还有多远?
新药从研发到上市的全流程,一文读懂IND、NDA、ANDA... ....