London Calling 2019 最新纳米孔测序技术升级

四员资深大将为你介绍纳米孔测序的各个方面，伴随设备和技术升级、到碱基识别和算法软件、纳米孔本身、以及测序试剂等的改进带来的准确度、数据通量、灵活性和用户体验的提升。

完整视频，建议在WiFi环境下观看:

视频要点

1. Nanopore产品和技术升级  Clive Brown 首席技术官

我们的目标是使任何人在任何地方测序任何生物，得到实时、富有信息的测序数据。

一系列的纳米孔测序设备可以满足所有需求，从超高通量到小型、再到便携式。纳米孔实时数据采集和分析提供动态的工作流和快速见解。

产品比较: 

https://nanoporetech.com/products/comparison

去年的多项发布已经为准确性、通量、分析和加强可用性做出了贡献。

• PromethION: 48张测序芯片，每一张都能按需要全部或独立运行。单张测序芯片内部最高通量220Gb，用户手中最高通量180Gb。我们已经在P48 的单次测序运行中获得了超过7Tb数据。PromethION 48每年可运行4500张测序芯片。

现在已有多项使用PromethION开展的大型项目: 人类X染色体、100天测序100个番茄基因组、10万人的结构变异分析。

• GridION:可运行高达5张MinION芯片或Flongle芯片，带机载碱基识别和计算的台式设备。下半年机载计算升级计划: 单个V100 GPU: 100 TFLOP(每秒峰值速度，描述计算性能), 650 W 功率预算。

• 推动便携式测序的边界，MinION Mk1C 测序设备整合高性能计算和高分辨率屏幕，可连接Sim卡和蓝牙。这个夏季推出在即。 

• Flongle是MinION和GridION的转换器，Flongle芯片可以随时随地进行快速、小型的测试，并已经在人们希望得到快速答案得小型实验中显示出价值。英国东英吉利大学的Justin O’Grady团队正在利用纳米孔进行的临床宏基因组学快速鉴定下呼吸道急性感染，并对Flongle进行了测试。

2. 软件 & 碱基识别  Stuart Reid 研发部资深主任

在未来几个月中将会有很多新功能被纳入纳米孔软件中，包括数据管理、识别修饰碱基、数据拆分以及用户需要对测序运行进行干预时的暂停功能。根据实验优先级的不同，提供不同的碱基识别选项，其中“快速”算法可用在时间结果至关重要的应用中。

原始（raw）和一致序列准确性（consensus）也是一个关键话题。新的“Flip-flop”算法已经为DNA和直接RNA的测序准确性带来了实质性的突破。Taiyaki算法允许用户训练自己的碱基识别器，进一步优化实验结果。Medaka通常用于从碱基识别中建立一致性序列（consensus），现在可用于识别纳米孔数据中的单核苷酸变体（SNVs）和插入缺失（indels）。

新的碱基识别方法可以用于过往的原始数据，信息都蕴含在信号中。Flip-flop碱基识别器已被纳入MinKNOW设备控制软件中，现在你不需要懂得命令行技能就可以得到最高的准确率。

MinKNOW是测序设备控制软件，是性能、数据管理、和可用性的关键。许多新的功能已经开始被整合到MinKNOW软件中，支持更好的用户体验。

就准确性，今天我将会讨论三点: 1. 原始 1D（单链） 准确率; 2. 一致性准确率（consensus accuracy）; 3. 变体识别（variant calling）。

第一点: 原始 1D（单链） 碱基识别 

• 我们每年都提供主要算法的提升：已经从开始的HMM，到RNN，到RNN传感器，到原始信号上的RNN，再到现在的Flip-flop。

• 在最新的碱基识别器中，每个碱基有两种状态：flip(正) 或Flop(反)。Flip-flop提升碱基识别性能，尤其是在均聚物方面（homopolymers）。

• 根据实验数据的需要，可以选择多种碱基识别模式选项: “快速”选项与传感器算法准确率相当；使用“高准确率”1D碱基识别器，DNA测序准确率约为~95%（原始准确率，modal），直接RNA测序准确率达94%（原始准确率，modal）。

• Taiyaki是新发布的训练工具，纳米孔社区的成员可以用它来训练自己应用的特定模型。Taiyaki可实时“同时”识别 5mC 和 6mA，从2019年7月起Guppy/MinKNOW软件也将支持这项功能。

可在Github下载：

https://github.com/nanoporetech/taiyaki

接下来呢？新研发中的Run Length Encoded 碱基识别器性能已经超越了Flip-flop。

第二点: 一致性准确率（consensus accuracy）

• Medaka是一个基于叠加序列的一致性序列修正工具，高度推荐使用以获得最佳的一致性准确性。

Medaka 现可以用于变体识别（variant calling）。使用纳米孔R9.4.1版芯片和最佳的工具，现在你可以进行SNPs识别，获得99%准确率。例如，使用当前的R9.4.1 版纳米孔, 利用Flip-flop碱基识别器和Medaka, 测序金黄色葡萄球菌（S.aureus）基因组，准确现达到Q44，其它的小型基因组准确率约 Q40。

可在Github下载：

https://github.com/nanoporetech/medaka

第三点: 结构变异识别（SV calling）

• 使用sniffles软件(可在GitHub下载): HG002基因组上达96% 召回率(recall)和精确率(precision)。

总结: 最近的碱基识别器可提供的1D（单链）准确率为：DNA 95% ；RNA 94%。使用正确的工具，在你现有的数据上，一致性准确率可高达Q44，SNPs达99%, SVs达96% (基于R9.4.1版芯片)。

3. 纳米孔和准确率  Lakmal Jayasinghe 纳米孔研究资深总监

目前的R9.4.1纳米孔是R9系列的一部分。它具有锐利的读取头，使其在混合序列区域表现非常好。要解决长度大于约5的均聚物的问题，其中一种方法是设计一种新型的纳米孔：R10就是我们的下一代纳米孔。使用更长的读取头，更多的基础支配信号。通过孔"看到”更长的均聚物（homopolymers），并且可以进行高准确度地解码。

R10现在可以提供与R9.4.1相当的原始读长准确度，在一致性准确性上已经远超过了R9.4.1，我们在运行条件和基本碱基识别算法方面进行了更多优化，以进一步提高通量，准确度和灵敏度。

去年5月，在内部测试中，使用R9.4.1 + R10芯片我们已经获得准确率Q41；2018年12月，仅使用R10芯片和Medaka，我们获得了Q42。到目前为止R10仅被一小部分纳米孔社区的科学家们进行过测试使用。在做大范围的发布前，我们还想进一步提升原始读长准确率、低样本起始量和通道数量。

最近几周，我们在单独使用R10时取得了进一步的进展，其中一部分是通过Medaka训练。在2019年5月，我们以30-50x的覆盖率达到>Q40，在金黄色葡萄球菌上以更高覆盖率已达到Q54。我们的目标是使R10的产量与R9.4.1一样大。我们现在可以在MinION R10芯片上获得26Gb测序数据，PromethION R10芯片上得到112Gb。

下一步是什么？

一个更好的R10。信噪比更好，更少堵孔，更好的产量，碱基识别器/模型，定制的一致性序列工具，针对直接RNA测序的改进……

我们有一条通往Q60数据的途径，包括新的化学成分，纳米孔的不同组合，新的碱基识别器和新的制备化学试剂。我们也会继续关注“R10b”、“R11”等等更新的纳米孔。

总的来说，R10即将到来，带着非常高的一致性准确度到来。

4. 测序试剂 Andy Heron 高级研究资深总监

样品制备的化学试剂也是纳米孔测序的基本组成部分，不断叠加的改进的强大在于他们为测序性能带来了显着提高。特别是从直接RNA测序（“基因组应用的新前沿”），到定性和定量cDNA测序，再到开发单分子一致性的多种方法。

Nanopore 样本制备相对简单，并且总有一种选择满足大部分的需求。 

为了实现我们任何人在任何地点进行测序分析的目标，作为迈向经济且无压力的DNA提取和制备的第1步，我们开发了“野外测序试剂盒”，使用冷冻干燥来消除对冷链运输的要求，并将在秋季推出该试剂盒的混样建库测序。

使用最新的109版cDNA试剂盒，假设转录本长度为1Kb的情况下，你可以在一张MinION芯片上得到近2千万条读长，从PromethION 芯片上得到1亿条读长。 

只有纳米孔技术能够直接测序天然RNA，而使用纳米孔进行直接RNA的方式将会成为接近主流。这个夏季末即将推出升级版的SQK-RNA003试剂盒。

测序燃料消耗: 纳米孔测序的核心是马达蛋白，它们通过消耗ATP来精准且有节律地逐步使DNA分子通过纳米孔。当加入高浓度的测序接头时，燃料消耗得就更快。尽管我们现在有ATP燃料补充法，我们希望为用户提供无人值守得测序。我们正在通过重新设计测序接头来开发新的再生化学试剂，我们希望您能够在无需查看的情况下运行PromethION 6天。

自动文库制备仪VolTRAX 2 比首版具备更好的用户体验。VolTRAX 2有加热元件，可加热到98C，让你可以在设备上进行PCR；磁性元件控制提取和纯化，以及光学元件让你可以测量DNA以便定量或进行质控。

仅靠算法我们的原始读长准确度提升到了约95%，我们并不认为这会是终点，它还会继续提升。对于一些应用来说，单个分子测序准确度达到Q30十分有用。我们目前正在研发获得Q30单分子准确率的方法，包括独特分子标识(UMIs)；能够产生>100Kb读长、包含原始分子的重复组成的线性和环状一致性方法；使用20x的滚动环状扩增。

5. 发布时间  Rosemary Dokos 资深产品管理总监  

随着通量和产量的持续提升，我们希望可以为大家提供更好的每Gb价格，现在Flongle推出了，加上PromethION的全面推出，大家有了完全的灵活度去做想做的事情，重要的是不论是每样本的价格还是每Gb的价格完全在大家掌控之中，欢迎大家持续给与我们反馈怎样给大家提供更好的产品和服务。

2019年9月20-26日，Oxford Nanopore Technologies将在香港、北京和上海三地举办纳米孔测序的技术之旅Nanopore Tech Tour ，包括全体会议、分组会议、闪电演讲、科研海报，您还可以参与测序运行从上样到结果分析的实践，与前沿纳米孔科学家交流，和纳米孔技术专家面对面讨论。

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