学术前沿| 发现FUBP1缺失可致低级别脑胶质瘤发生 康奈尔大学与华山神外合作研究成果发表

学术前沿

第27期 

神外前沿讯，低级别脑胶质瘤病因学的研究，最近出现了可喜的进展。

近日，纽约威尔康奈尔医学病理学和实验医学系Jihye Paik教授团队主导、华山医院神经外科姚瑜教授参与的研究《Far Upstream Element-Binding Protein 1 Regulates LSD1 Alternative Splicing to Promote Terminal Differentiation of Neural Progenitors》发表于2018年《Stem Cell Reports》(IF=6.5)上，阐述了FUBP1在神经元分化中的直接作用，并解释了其在神经系统中的肿瘤抑制功能。

据了解，FUBP1在成年人大脑中广泛表达，主要在神经元的细胞核中可以被观察到；而在少突胶质细胞胶质瘤或星形胶质细胞胶质瘤中却显示出非常低的FUBP1表达，因此猜测FUBP1在低级别胶质瘤的产生中起到关键的作用。

有数据显示，低级别胶质瘤约占胶质瘤发病总人数的四分之一左右，其致病因素目前尚不清楚。

虽然低级别胶质瘤生长相对缓慢，预后相对较好，但目前仍缺乏有效的治愈手段，而且低级别胶质瘤有复发和转化为高级别胶质瘤的倾向，目前在临床上仍存在较高的致残率和病死率（5年生存率50%-60%；10年生存率40%-50%）

图1成人神经形成过程中FUBP1的表达受到动态调节

（A-C）在成年小鼠海马齿状回中NESTIN（A），NeuN（B）或DCX（C）共染色的FUBP1的免疫荧光分析。（D）FUBP1阳性细胞的定量定位分析。（E）成年海马神经发生期间FUBP1表达变化的总结。（F）在分化开始后的指定时间通过NPC对神经元标志物和FUBP1表达进行qRT-PCR分析。（G）增殖和分化NPCND1（+多西环素）细胞的代表性蛋白质印迹分析。

在神经生成过程中FUBP1的动态表达

该实验研究了FUBP1在成人大脑神经源性区域的表达，以了解其在大脑发育过程中的作用。它在NESTIN阳性祖细胞和NeuN阳性成熟神经元中高度表达（图1A和1B）。

值得注意的是，颗粒细胞区中的双皮质素（DCX）阳性成神经细胞显示低至无信号，而颗粒细胞层中的迁移细胞将其表达增加至中等至强水平（图1C和1D）。这些结果表明FUBP1的表达在神经发生过程中是动态调节的，并且可以控制神经元谱系和成熟为终末分化神经元的关键步骤（图1E）。

在神经干细胞中FUBP1在NESTIN + NPC和终末分化的NeuN +细胞中高度表达。相反，其表达在早期分化期间低至不可检测，其以加速方式终止分化为NeuN阳性神经元。在强力抗生素存在下，NPCND1细胞在2天内有效分化为表达DCX的成神经细胞。在该系统中，几乎所有细胞在5-7天内变得静止，这可通过长时间暴露后缺乏5-溴-20-脱氧尿苷（BrdU）阳性细胞来证明。在早期分化期间，FUBP1的表达下降，随后逐渐增加，而神经元标记物NeuN在mRNA和蛋白质水平上继续增加（图1F和1G）。这些结果证实了我们的发现，即FUBP1表达在神经元分化期间受到调节。

图2 FUBP1表达缺失削弱了终末神经元分化

（A）对多西环素存在（+ DOX）或不存在（DOX）时分化的NPCND1 NTKD或NPCND1 FUBP1KD的细胞荧光染色。（B和C）MAP2a / b和溴脱氧尿苷（BrdU）存在时的细胞免疫荧光分析。（D和E）通过qPCR测定NPCND1分化。（E）SRRM4和FUBP1的相对mRNA表达水平。

验证FUBP1的缺失抑制末端神经元分化

为了再确定终末分化受损是否是由于未能退出细胞周期，我们进行了基于DNA合成的细胞增殖（图2A和2B）。 BrdU阳性NPCND1细胞的数量在分化开始的48小时内下降，并且分化在时间延长（5-7天）后变得不可检测（图2C）。令人惊讶的是，一部分NPCND1 FUBP细胞在多西环素诱导分化后第7天继续掺入BrdU，仍然可以持续保持增殖。即使没有强制表达NeuroD1，与NTKD细胞相比，FUBP1KD细胞显示出更高的BrdU掺入性（图2C）。这些结果表明FUBP1对于终末神经元分化的完整细胞周期退出是必需的。为了更好地确定受FUBP1损失影响的细胞周期退出的分子机制，我们对分化的NTKD和FUBP1KD培养物进行了RNA测序（RNA-seq）分析。我们进一步测试了细胞周期失调在FUBP1KD细胞的持续有丝分裂表型中的作用。 PD0332991（CDK4 / 6抑制剂）的治疗抑制BrdU掺入但未能恢复神经元分化。这些结果共同表明持续增殖是由于终末分化受损而不是FUBP1在细胞周期调节中的直接作用。

图3 FUBP1与NPCs中IDH1R132H和PIK3CAH1047R表达缺失促进原位肿瘤生长

（A）具有1p19q共缺失的ODG患者样品（n = 12）中FUBP1的代表性WB分析。（B）来自（A）的肿瘤的LSD1 + 8a和LSD1_8a mRNA水平的qPCR分析。*p <0.05; （C）BrdU掺入分化的IDH1R132H NTKD与IDH1R132H FUBP1KD NPC（第1-5天）的免疫荧光分析。刻度条，50 mm。 来自代表性实验的BrdU阳性细胞的定量绘制在右侧的图中（来自5个独立实验的平均值±SEM）。 统计显着性通过非配对t检验确定。

IDH1^R132H突变型小鼠中FUBP1的缺失会促进体内肿瘤发生

FUBP1突变与IDH1/2突变（分别为R132H或R172K）和19q13中的capicua（CIC）中的失活突变相关。尽管有丰富的遗传学证据，但FUBP1功能丧失突变如何导致胶质瘤形成的机制仍不清楚。在此基础上，我们首先测试了FUBP1敲低和NPC培养中IDH1R132H表达的联合作用。图3C表明FUBP1对于NPC的完整细胞周期退出是必需的。接下来，为了确定由FUBP1缺失引起的致癌潜力，我们进行了对照或FUBP1下调的IDH1R132H PIK3CAH1047R（IP）NPC的肿瘤发生分析（图3D）。 PIK3CAH1047R具有PIK3CA（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基a）的活化突变之一，并且在实验中加速了肿瘤发生。值得注意的是，颅内注射FUBP1KD IP NPC导致肿瘤生长并降低荷瘤的动物的总体存活率。 NTKD IP NPC未能生长肿瘤（图3E和3F），表明FUBP1的缺失是启动肿瘤发生所必需的。最后，我们在FUBP1KD IP NPC中强制执行LSD1 + 8a表达以测试恢复终末分化是否抑制肿瘤发生。与我们的机制模型一致，LSD1 + 8a表达阻止体内FUBP1KD IP NPC的生长（图3G）。因此，我们发现FUBP1的缺失是启动低级别胶质瘤发生的关键因素。

低级别胶质瘤5年生存期较胶母等恶性肿瘤较长，但是以目前的临床治疗手段仍然无法达到治愈。因此除了外科切除+术后综合治疗外临床上仍然迫切需要一种新的治疗方法改善患者预后。

该研究表明了FUBP1缺失会促进低级别胶质瘤的生成，为临床上低级别胶质瘤的初发与复发预判提供新的思路，并为胶质瘤的新型治疗手段提供理论依据。

附：研究成果 全文

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研究团队简介

姚瑜，博士，主任医师、博士生导师，复旦大学附属华山医院神经外科脑胶质瘤外科中心副组长,免疫室主任。师从于周良辅院士,目前是美国癌症登月计划国际成员，上海抗癌协会青委会副理事长，曾任中国胶质瘤指南编写组秘书兼主要成员，中国胶质瘤协作组秘书。是美国journal of neuro-oncology, 《中华神经外科杂志》、《中华医学杂志》的审稿专家；国家自然科学基金委评议专家。擅长各种脑肿瘤（胶质瘤、脑膜瘤、转移瘤、垂体瘤、听神经瘤、髓母瘤等），脊髓肿瘤（椎管内外神经鞘瘤、髓内肿瘤等）等神经外科疑难杂症的显微外科微创治疗以及创新综合治疗策略。

学术前沿往期报道

[学术前沿]脑胶质瘤诊疗关键技术创新与推广应用介绍-江涛尤永平王伟民等 | 2017国家科技进步二等奖

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