东华大学沈明武研究员/史向阳教授课题组在树状大分子纳米凝胶用于肿瘤增强CT/MR双模态成像上取得新进展

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作为常用的临床成像技术，计算机断层扫描（CT）成像具有优异的空间和密度分辨率，而磁共振（MR）成像能提供高灵敏度和卓越的软组织对比度。然而，因为单一模态成像具有内在的优点和不足，仍然难以获取全面准确的肿瘤诊断信息。为解决这一问题，CT/MR双模态成像技术引起人们的重视。然而，基于小分子的常规造影剂缺乏肿瘤特异性，代谢快，高浓度时产生肾毒性。因此，开发具有特异性肿瘤靶向能力的CT/MR双模态成像纳米探针至关重要。

由于纳米级的颗粒或者药物普遍在实体瘤组织具备高渗透长滞留的EPR效应，因此构建合适的纳米探针材料通过放大其EPR效应，可大大提高其成像诊断灵敏度和准确度。聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子是一类高度支化的、三维立体结构的单分散大分子。由于其具有良好水溶性、非免疫原性和易官能化等优点，沈明武研究员/史向阳教授课题组在前期研究中，利用第5代（G5）或第2代（G2）PAMAM树状大分子负载双模态造影剂，用于肿瘤的CT/MR或SPECT/CT成像（ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 15212−15221；ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8, 19883−19891）。然而基于单个树状大分子的纳米探针材料尺寸相对较小，使得其EPR效应受到限制。该团队最近的研究证实几何尺寸大于单代树状大分子的核壳结构树状大分子显示出比单个树状大分子纳米颗粒更高的肿瘤穿透能力和放大的肿瘤EPR效应（Biomacromolecules 2021, 22, 2181−2188）。

纳米水凝胶作为一种由高分子链通过物理或化学交联形成的高度亲水的三维网络结构，同时展现出了纳米颗粒及水凝胶所具有的特性：（1）高流动性和柔韧性，能够更好地穿过血管上皮细胞间间隙，进入肿瘤区域，从而被肿瘤细胞吞噬；（2）高亲水性，在体内可以保持相对较长的循环时间；（3）通过设计环境响应性的交联剂或高分子链，可实现纳米体系在体内特定区域的响应性释放，减少药物副作用。此外，已证明具有两性离子表面修饰的纳米粒子显示出优异的抗污性能，延长的血液循环时间，从而使纳米药物更容易被肿瘤细胞吞噬。基于前期的研究成果，该团队考虑结合树状大分子与纳米凝胶的优点及纳米凝胶的放大的EPR效应，合成了功能化树状大分子纳米凝胶用于增强肿瘤CT/MR双模态成像。

在本研究中，该团队首先通过反相微乳液法，通过氨基封端的第三代树状大分子（G3·NH₂）与N、N′-双（丙烯酰基）胱胺（BAC）的Michael加成交联反应，制备纳米凝胶。之后，通过金酸盐快速还原，将金纳米颗粒包裹在纳米凝胶中。进一步对纳米凝胶表面修饰DTPA/Gd（III）螯合物、聚乙二醇化RGD和1,3-丙烷磺酸内酯（图1）。形成的RGD-Gd@Au-DNGs-PS（简称R-G@ADP）具有均匀的球形形态、均一的纳米尺寸（平均粒径为122 nm）、较好的稳定性和细胞相容性。为便于对照，团队还使用mPEG代替PEG-RGD制备了非靶向对照材料Gd@Au-DNGs-PS（简称G@ADP），合成了包裹纳米金和螯合Gd(III)的单代树状大分子纳米颗粒G3@Au-Gd-PS（简称G3@AGP）。

图1. 树状大分子纳米凝胶（A）和R-G@ADP（B）的合成示意图。

随后，团队使用Cy5.5对三种材料进行了荧光标记，并以鼠源胰腺癌细胞（Panc-2）为模型，在体外构建了3D细胞球模拟体内实体瘤微环境，比较三种材料的肿瘤渗透能力。如图2所示，三种材料均对细胞球有一定的渗透性，但在相同Cy5.5浓度下，R-G@ADP组和G@ADP在细胞球内部的荧光强度显著高于G3@AGP组，这表明纳米凝胶组由于具有增强的EPR效应，使得对细胞球的渗透能力远远优于纳米颗粒组。

图2. （A）使用R-G@ADP或G@ADP在不同Au浓度下孵育24小时后Panc-2细胞的活力。（B）在不同Au浓度下，将R-G@ADP、G@ADP以及G3@AGP与Panc-2细胞孵育4小时后细胞内金元素的吞噬量。（C）Cy5.5-R-G@ADP、Cy5.5-G@ADP以及Cy5.5-G3@AGP（2mg/mL）分散在水中的荧光光谱图。（D）使用Cy5.5-R-G@ADP、Cy5.5-G@ADP以及Cy5.5-G3@AGP（[Au]＝2000 nM）孵育Panc-2细胞4 h后的流式细胞术分析图和（E）相应的平均荧光强度。（F）用Cy5.5-R-G@ADP、Cy5.5-G@ADP以及Cy5.5-G3@AGP孵育Panc-2 3D细胞球后的激光共焦显微镜图片和（G）荧光强度分布统计图。其中，比例尺为50 μm，（1）、（2）以及（3）代表Cy5.5-R-G@ADP组，Cy5.5-G@ADP以及Cy5.5-G3@AGP组。

接下来，团队在小鼠皮下建立了Panc-2的移植瘤模型，通过尾静脉注射的方式对注射材料前后的荷瘤小鼠进行了CT/MR成像。结果如图3所示，R-G@ADP、G@ADP以及G3@AGP组的小鼠肿瘤部位CT/MR信号强度均显示先增大后减小的现象。R-G@ADP和G@ADP组的CT/MR信号强度90 min达到了最高值，而G3@AGP组仅在60 min就达到了最高值。纳米凝胶组的CT/MR信号强度均高于G3@AGP组，主要应归因于其延长的血液循环时间，放大的被动EPR效应，使其更容易在肿瘤部位保留和积聚。此外，靶向纳米凝胶组R-G@ADP的SNR和HU值均高于非靶向纳米凝胶组G@ADP，这主要是靶向组R-G@ADP连接RGD配体结合Panc-2细胞表面过表达的整合素α_vβ₃，使其产生特异性靶向效应。总之，纳米凝胶R-G@ADP表现出放大的肿瘤EPR效应，达到增强肿瘤CT/MR成像的效果。

图3. （A）静脉注射R-G@ADP、G@ADP以及G3@AGP前后不同时间点的体内肿瘤MR成像图和（B）SNR统计图。（C）静脉注射R-G@ADP、G@ADP以及G3@AGP前后不同时间点的体内CT成像图和（D）CT值（HU）统计图。（1）、（2）以及（3）代表R-G@ADP、G@ADP以及G3@AGP（[Au] = 0.1 M，[Gd] = 0.01 M，100 μL PBS）。

以上研究以“Multifunctional Low-Generation Dendrimer Nanogels as an Emerging Probe for a Tumor-Specific CT/MR Dual-Modal Imaging”为题，发表在美国化学会期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.2c01403)上。东华大学化学化工与生物工程学院硕士研究生徐旭为第一作者，东华大学史向阳教授、沈明武研究员为共同通讯作者。该工作得得到了国家自然科学基金委、上海市科委等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.biomac.2c01403

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